研究背景大面积烧伤患者需要尽快高效的封闭创面,以预防细菌等病原生物侵入、防止水电解质、体液及能量等丢失。目前普遍认为,适宜的创面敷料能迅速重建皮肤屏障、促进愈合创面,或为后续植皮等手术做好准备。此外,适宜的烧烫伤创面敷料还需具有下述优点,如良好的生物相容与安全性、良好的力学性能、保持创面局部合适的湿性愈合环境、价格低廉等。当然,感染、炎症反应失调等会引起创面的愈合减慢甚至不愈合。而天然材料如甲壳素、壳多糖、葡聚糖类、纤维素类、海藻酸盐、蚕丝蛋白等,由于取材方便,具有良好的生物相容性,被认为是用作制备创面敷料的很好的材料。因此,天然材料负载各种抗菌制剂、生长因子或者其他化学物质促进感染性创面的愈合已成为创面修复领域研究的热点及重点。做为一种天然材料及可再生资源,木材具有低密度,高模量,高强度,高韧性和导热系数低等特性。而轻木是目前世界上最轻的商品用材,因其具有溶重最小、材质均匀、导热系数较低、易加工且体积稳定性较好等性质,轻木可以用做各种特殊结构物。目前,已有相关研究可对轻木进行去木质素处理,形成透光率既可达到90%,又可保持基本构架的新型半透明轻木。若其用做创面敷料基础物,可具有造价低廉、透气透光性好及常见敷料的相关作用。溶菌酶是一种小型单体蛋白质,含129个氨基酸残基,具有抗炎、抗病毒、杀菌及抗组胺活性,目前已广泛用于抗菌。其杀菌机制主要表现为生物化学功能,即针对肽聚糖层这一细胞壁基本组成单元进行水解催化,从而破坏微生物细胞壁,最终实现杀菌。此外,溶菌酶的抗病毒机制在于其可与病毒蛋白(带负电荷为主)产生对应反应,从而让其失活。溶菌酶用于酶类抗菌物质时,其能产生较强的消炎功效,对粘多糖代谢产生影响,其还可诱导较多的酸性介质介导炎性失活反应,使相关抗菌物质药效得到增强,最终实现修复细胞组织及炎症减轻。因而,作为人体正常组织及体液中的非特异免疫因子,溶菌酶可调节机体免疫效应,兼具较多的药理功效,从而维持机体生理平衡。本研究中,我们成功利用去木质素技术优化轻木结构,并采用多巴胺胶粘法将不同浓度的溶菌酶粘附其中。同时利用扫描电镜观察其微观结构、傅里叶红外光谱及接触角检测其化学物理性能、载药量及包封率检测溶菌酶负载情况、药物释放试验检测溶菌酶缓释效果等。采用金黄色葡萄球菌及大肠杆菌共培养检测其体外抗菌活性、CCK-8法检测其体外细胞增值抑制。最后,建立小鼠感染创面模型,观察小鼠创面的大体愈合情况,并进行HE染色检测新生上皮长度。同时,本研究还在成功制备溶菌酶-轻木新型敷料的基础上,继续利用半透明化技术优化去木质素轻木结构。并针对溶菌酶对革兰阴性菌抑菌能力较弱的特点,采用肉桂酸、咖啡酸及对香豆酸作为改性剂,并对比筛选最优改性剂。为进一步明确新型敷料促进创面愈合的相关机制,我们在采用与原材料相同生物学评价方法的基础上,利用RT-PCR、WB、划痕实验等技术进行深入研究。明确了改性溶菌酶-半透明轻木可有效促进感染创面愈合,并影响相关分子机制。目的本研究拟研究并优化溶菌酶-轻木敷料、改性溶菌酶-半透明轻木敷料的制备流程,并分别观察其对感染创面愈合的影响。在此基础上探讨了溶菌酶-轻木敷料、改性溶菌酶-半透明轻木敷料促进创面修复的相关分子机制。方法1.溶菌酶-轻木敷料的制备通过去木质素技术优化原始轻木结构,并采用多巴胺胶粘法将不同浓度的溶菌酶分别粘附其上。2.溶菌酶-轻木敷料的表征利用扫描电镜观察其微观结构,傅里叶红外光谱观察相关物质是否粘附,接触角检测敷料亲疏水性变化。采用载药量及包封率检测溶菌酶负载情况,药物释放试验检测溶菌酶缓释效果等。3.不同浓度的溶菌酶-轻木敷料对创面愈合的影响先采用与金黄色葡萄球菌及大肠杆菌共培养检测敷料的杀菌功效,其次通过CCK-8法将敷料与成纤维细胞共培养,检测其生物毒性。最终依据其体外实验结果,构建小鼠全层皮肤缺损感染模型,检测敷料对小鼠创面愈合率、创面完全愈合时间影响,并进行HE染色探讨新生上皮长度变化。4.改性溶菌酶-半透明轻木敷料的研制及流程优化通过MMA等处理从而半透明化轻木,进而选用咖啡酸、肉桂酸及对香豆酸作为改性剂,利用细菌圈、最小抑菌浓度、细菌共培养、最适PH+温度+时间、疏水性测定、二级结构测定筛选出最佳改性剂等。5.改性溶菌酶-半透明轻木敷料的表征及生物学功能评价制备溶菌酶标准曲线,测定敷料载药率及包封率,并测定其体外释放曲线。先采用与金黄色葡萄球菌及大肠杆菌共培养检测敷料的杀菌功效,其次通过CCK-8法将敷料与成纤维细胞共培养,检测其生物毒性。最终依据其体外实验结果,构建小鼠全层皮肤缺损感染模型,检测敷料对小鼠创面愈合率、创面完全愈合时间影响,并进行HE染色探讨新生上皮长度变化;6.改性溶菌酶-半透明轻木敷料促进创面愈合的相关机制研究采用RT-PCR方法检测敷料对Wnt3a,β-catenin,and PCNA mRNA影响,采用细胞划痕实验观察敷料对24 h内细胞迁移的影响,采用WB检测Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及F-actin、vinculin迁移相关蛋白变化。结果1.溶菌酶-轻木敷料的表征1.1成功制备溶菌酶-轻木敷料,并依据浓度分别设置对照组(去木质素轻木),A组(多巴胺胶粘),B组(5mg/ml溶菌酶),C组(10mg/ml溶菌酶),D组(15mg/ml溶菌酶),E组(20mg/ml溶菌酶)。1.2高倍扫描电镜下可见析出成团的溶菌酶球形颗粒物及铺垫的多巴胺胶体层,傅里叶红外光谱显示溶菌酶已粘附并检测相应吸收峰,接触角测试说明随着溶菌酶浓度的逐步升高,材料亲水性稍有改变。2.不同浓度的溶菌酶-轻木敷料对创面愈合的影响2.1体外实验表明:溶菌酶-轻木敷料包封率可达到60%,E组敷料48h释放曲线可达到92.3%;抑菌试验显示,溶菌酶-轻木敷料可有效抑制金葡菌及大肠杆菌生长(P<0.05),且仅有E组在第7日对成纤维细胞生长有轻微抑制作用(P<0.05)。2.2体内实验表明:Control组,A-E组的小鼠7日创面愈合率分别为30.7%,38.3%,50.7%,61.2%,61.9%和62.4%(P<0.05),创面完全愈合时间亦为D,E组最短(P<0.05)。而7日后Control组,A-E组新生上皮长度分别为631.7μm,702.5μm,759.4μm,825.3μm,831.7μm和836.6μm(P<0.05)。3.改性溶菌酶-半透明轻木敷料的制备3.1酶活性研究显示:抑菌圈直径,最小抑菌浓度,细菌共培养等多项指标均显示对香豆酸最优,好于咖啡酸及肉桂酸(P<0.05);表面疏水指数及二级结构稳定性亦为对香豆酸最优,且测得对香豆酸-溶菌酶在PH=6,温度45℃,反应时间30min时效果最佳。3.2依据改性敷料重新设计研究,分组为A组(轻木),B组(半透明轻木),C组(溶菌酶-半透明轻木),D组(对香豆酸-溶菌酶-半透明轻木)。4.改性溶菌酶-半透明轻木敷料的表征及生物学功能评价4.1材料学表征显示:D组的载药率及包封率均略优于C组(P<0.05),C,D组的72小时释放率分别为85.2%,93.8%。而在拉伸强度方面,A组低于D组(P<0.05),水蒸气透过率方面,D≈C≈B>A(P<0.05)。4.2生物学评价显示:24h后各组对大肠杆菌及金葡菌的抑菌活性分别为D>C>B≈A(P<0.05),而与成纤维细胞的毒性试验显示各组均无明显细胞毒性(P>0.05)。7日后小鼠创面愈合率分别为30.6%,48.3%,56.7%,70.9%和79.2%(Control组,A-D组),新生上皮长度亦为D>C>B>A>Control(P<0.05)。5.改性溶菌酶-半透明轻木敷料促进创面愈合的相关机制研究5.1细胞增殖机制:RT-PCR发现Wnt3a,β-catenin及PCNA mRNA增殖均为D>C>B≈A>Control(P<0.05),通过WB检测Wnt/β-catenin信号通路发现,增殖蛋白PCNA的表达为D>C>B≈A>Control(P<0.05),而Axin表达为D<C<B≈A<Control(P<0.05),但各组的GSK-3β表达无差异(P>0.05)。当添加Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939后,D组Wnt3a,β-catenin及PCNA蛋白表达降低,Axin2表达升高(P<0.05)。5.2细胞迁移机制:24h迁移试验显示,迁移率分别为D>C>B≈A>Control(P<0.05)。而WB对迁移相关蛋白F-actin及vinculin影响显示,D>C>B≈A>Control(P<0.05),趋势一致。结论总结本课题的研究结果,可以得到以下结论:1.我们通过去木质素技术及多巴胺胶粘方法成功制备了溶菌酶-轻木抗菌敷料,并通过相关材料学表征证实了适宜浓度的溶菌酶能成功粘附于轻木。2.溶菌酶-轻木在体外可有效抑制金葡菌及大肠杆菌生长,且对成纤维细胞的生物毒性较低,并可有效促进小鼠感染创面愈合及新生上皮生长。3.酶活性实验表明,成功利用MMA及对香豆酸改性溶菌酶,并成功将其粘附于半透明轻木。4.改性溶菌酶-半透明轻木敷料在体外可有效抑制金葡菌及大肠杆菌生长,且兼具美观、对革兰阴性菌作用强、稳定好等优点,并还可有效促进小鼠感染创面愈合及新生上皮生长。5.相关机制研究表明,改性溶菌酶-半透明轻木敷料可通过促进细胞增殖及迁移,从而促进创面愈合。