背景生长因子（GFs）是一类对细胞生长、分化发挥调节作用的肽类分子,主要通过自分泌或旁分泌机理起作用。GFs在肺的形态功能发育过程中通过介导组织间相互作用以及对细胞功能的调节,参与肺脏模型形成、生长及细胞分化等各个环节,它们在肺组织正确的时空表达是维持正常肺发育的必要条件。GFs还参与肺损伤修复反应。急性肺损伤可诱导GFs表达增加,使细胞发生修复性增殖从而促进肺损伤修复,但GFs的不恰当表达将引起异常修复反应（重塑性增殖）,从而导致肺组织永久性结构与功能障碍。机械通气是危重呼吸衰竭的重要救治手段,但亦会导致呼吸机相关性肺损伤（VALI）。早产肺具有发育不成熟的特点,机械通气时更容易损伤肺。炎症是机械通气诱发肺损伤的重要机制,进一步可使肺发育停滞,发展为支气管肺发育不良（BPD）等慢性肺疾病。此外,肺部炎症性损伤可以进一步发展为肺外脏器的损伤,如肾、脑、心、消化道等,出现临床全身性炎症反应综合征（systemicinflammatory reaction syndrome）,亦或仅局限于肺外单个脏器,如导致不名原因的婴儿期脑损伤或运动发育障碍。GFs作为肺发育和肺损伤修复的重要调控因子,在机械通气诱发的肺炎症损伤及修复或重塑过程中可能发挥重要作用。BPD的发生与GFs的不恰当表达有关,但关于生后早期机械通气对早产肺GFs表达的影响及其与炎症反应的关系尚不清楚,对这一问题的探讨将有助于阐明VALI的发生发展机制。应用恰当的机械通气方式可以减轻VALI,呼气末正压（PEEP）是呼吸机治疗中设置的一种供气模式,即通过增加排气阻力达到保持呼气末肺泡适度扩张的状态,理想水平应接近肺功能余气量（functionl residual capacity）,使气体交换效率提高,呼吸作功减少。PEEP对VALI的保护作用在动物实验及临床研究中以往主要针对呼吸力学和气血交换功能得以证明,包括针对机械通气早产肺的影响亦有报道。但关于PEEP对不成熟肺是否具有预防炎症性损伤的作用尚不清楚,不同PEEP水平机械通气对早产肺中促炎症细胞因子和GFs表达的影响少有研究。吸入一氧化氮（iNO）和肺表面活性物质（PS）是救治新生儿低氧性呼吸衰竭（HRF）的重要手段,常与机械通气同时用于新生儿HRF的治疗。NO的主要药理机制是选择性扩张肺血管,通过降低肺动脉压或增加通气肺泡血流起到改善氧合的作用;并可抑制肺内中性粒细胞聚集和活化,下调肺泡巨噬细胞NF-κB活性,以减轻肺的炎症性损伤。NO还可防止肺损伤后肺发育异常的发生,许多学者认为此现象与NO的抗炎作用有关,但具体作用途径有待于阐明。近来,有研究显示NO可调节GFs的表达,提示NO可能通过调节GFs的表达发挥对未成熟肺的保护作用。基于上述背景,本研究第一部分旨在探讨不同PEEP水平机械通气对早产肺组织中GFs和促炎症细胞因子表达的影响,及应用NO和/或PS干预时上述细胞因子的变化特点。以往研究显示不同成熟度的肺组织对VALI的易感性不同。对机械通气的反应性不同是否也反映在肺组织中GFs和促炎症细胞因子的表达也是有待研究的内容。在第二部分研究中,我们观察并比较机械通气对不同发育阶段（足月新生猪和幼猪）肺内GFs表达和炎症反应的影响。另外,我们分析了从晚期胎肺至生后早期正常猪肺组织中GFs的表达规律,这对探讨GFs在肺发育中的作用、生后早期肺疾病的发病机制,以及呼吸机治疗相关的肺部炎症反应性具有一定的意义。GFs种类繁多,与肺泡化及肺损伤修复关系较为密切的GFs包括血小板源性生长因子（PDGF）B、胰岛素样生长因子（IGF）I、角化细胞生长因子（KGF）、肝细胞生长因子（HGF）、血管内皮生长因子（VEGF）以及转化生长因子（TGF）β1。本课题将重点对上述GFs进行研究。肺损伤过程中GFs表达的分子调节机制尚不清楚,但研究提示GFs表达改变可能与炎症反应有关:首先,肺部炎症反应是各种原因（如气压伤、高氧、感染）引起肺损伤的主要发病机制,可启动肺损伤修复反应,而损伤修复过程与GFs水平变化有关;其次,肺炎症反应是生后肺发育障碍的重要相关因素,肺发育障碍与GFs有直接关系,后者通过调节细胞的增殖分化对肺发育及重塑起调控作用。本研究第一部分结果显示IL-1β、IL-6 mRNA表达与PDGF-B、IGF-I之间存在相关关系,亦提示炎症反应对GFs的影响作用。为探讨IL-1β和IL-6是否对PDGF-B和IGF-I的表达具有调节作用,在本研究的第三部分,我们以原代培养的新生猪Ⅱ型肺泡上皮细胞（AEC-Ⅱ）为研究对象,观察IL-1β和IL-6对AEC-Ⅱ中PDGF-B、IGF-I表达水平及细胞功能（增生能力、肺表面活性物质相关蛋白（SP）A/B）的影响。本研究预期能够通过新生猪在体实验和体外细胞与分子生物学技术,阐明肺保护性通气策略对炎症损伤调节作用机制,为临床建立规范化的急性肺损伤呼吸治疗、促进组织修复提供依据。目的1.观察不同水平PEEP,iNO和PS对机械通气早产猪（胎龄97-100天）肺内GFs及促炎症细胞因子表达的影响,并探讨GFs与促炎症细胞因子表达水平之间的相关性;2.观察小潮气量常规机械通气下足月新生猪（生后1天）和幼猪（生后4-5周）肺内GFs表达变化特点及炎症反应情况;3.体外观察促炎症细胞因子刺激下AEC-Ⅱ表达GFs的特点,并探讨GFs表达变化对AEC-Ⅱ增生能力及SP-A/B表达水平的影响。方法1不同水平PEEP,iNO和PS对机械通气早产猪肺内GFs和促炎症细胞因子表达的影响本部分实验动物取自实验室前期实验研究（参见:钱莉玲.新生儿急性呼吸衰竭的临床和实验研究[D].上海:复旦大学,2005）。选择97-100天孕龄（85%足月孕期）母猪,行剖宫产获得48头早产猪,气管插管后随机分为低（5-6cmH₂O,PEEP5）和高（10-12 cmH₂O,PEEP10）PEEP进行机械通气,并给予iNO和/或PS干预,共计8组（每组n=6）:PEEP5（C5组）:PEEP5+NO（NO5组）:PEEP5+PS（PS5组）;PEEP5+NO+PS（SNO5组）;PEEP10（C10组）:PEEP10+NO（NO10组）;PEEP10+PS（PS10组）:PEEP10+NO+PS（SNO10组）。采用压力控制模式进行机械通气,初始参数设置:吸气峰压（PIP）20 cmH₂O,PEEP 5-6cmH₂O或10-12 cmH₂O,吸呼比（I:E）1:1.5-2,呼吸频率（RR）50次/分,呼出气潮气量（Vte）6-8 ml/kg,吸入氧浓度（FiO₂）80%。实验过程调节PIP和FiO₂使血气维持在pH 7.25-7.45,PaO₂ 50-80 mmHg,PaCO₂ 35-60 mmHg,治疗观察6h。猪PS制剂100 mg/kg气管内滴入,NO气体以10 ppm浓度连续吸入。另外,取未机械通气的同窝早产猪作为自主呼吸对照组（SB组,n=6）。动物处死后,取部分右肺中叶于液氮中保存,待测GFs（PDGF-B、IGF-I、KGF、HGF、VEGF、TGF-β1）和促炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）mRNA表达。左肺用多聚甲醛灌流固定后石蜡包埋切片,用于GFs免疫组化检测或病理形态分析。2小潮气量常规机械通气对足月新生猪和幼猪肺内GFs表达及炎症反应的影响本部分幼猪取自实验室前期实验研究（参见:①汪薇.实验性急性肺损伤肺修复策略与生命支持的研究[D].上海:复旦大学,2007:②汪薇,等.体外膜肺对急性呼吸窘迫综合征幼猪肺生理和病理的影响[J].中华急诊医学杂志,2007,16:685-689）。分别将足月新生猪和4-5周龄幼猪随机分为机械通气组（MV组）和自主呼吸对照组（SB组）（幼猪机械通气组n=5,其余各组每组n=6）。机械通气组动物气管切开插管后接呼吸机辅助通气,均采用压力控制模式,初始参数设置:PIP 6-10 cmH₂O,PEEP 0 cmH₂O,I:E 1:1.5,RR 40次/分（新生猪）或30次/分（幼猪）,Vte 6-8 ml/kg,FiO₂ 30%。上机稳定10 min后作为实验0点并检测血气及呼吸力学参数,然后每隔1 h测血气和呼吸力学参数1次。实验过程中调节PIP和FiO₂使血气维持在pH 7.25-7.45,PaO₂>60mmHg,PaCO₂30-50mmHg。机械通气24 h后处死动物,取部分右肺中叶测定肺组织湿干重比（W/D）;余置液氮中待测GFs（PDGF-B、IGF-I、KGF、HGF、VEGF、TGF-β1）和促炎症细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α）mRNA表达以及髓过氧化物酶（MPO）含量。剩余右肺行肺泡灌洗,测支气管肺泡灌洗液（BALF）中总磷脂（TPL）、总蛋白（TP）及饱和磷脂酰胆碱（DSPC）含量。左肺用多聚甲醛灌流固定后石蜡包埋切片,用于GFs免疫组化检测或病理形态分析。3促炎症细胞因子对原代培养的新生猪AEC-Ⅱ中GFs mRNA表达水平的影响及意义分离新生猪的AEC-Ⅱ,经碱性磷酸酶（AKP）染色鉴定,纯度在90%以上。4×10⁵细胞/cm²密度接种于六孔板,置于37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。24h后去除未贴壁细胞,更换含10%FBS的DMEM新鲜培养基。换液后细胞分为对照组和实验组,实验组分别加入不同剂量(1 ng·ml^-1,10 ng·ml^-1,100 ng·ml^-1)的促炎症细胞因子（rhIL-1β或rhIL-6）,每组设3个复孔。继续培养48 h后收集细胞待测GFs（PDGF-B、IGF-I）及SP-A/B mRNA表达。细胞接种24 h第一次换液后以及实验结束时（即给予干预后48 h）进行两次细胞计数,计算48 h内细胞增生倍数=（第二次细胞计数/第一次细胞计数）×100%,以判断并比较各组AEC-Ⅱ的增生情况。上述实验重复2次。实验结果显示rhIL-1β和rhIL-6导致AEC-Ⅱ增生能力及SP-AmRNA表达水平降低,并同时伴有IGF-I mRNA表达减少。为进一步研究AEC-Ⅱ增生能力和SP-A mRNA水平降低是否与IGF-I有关,进行以下实验:将原代培养24 h的新生猪AEC-Ⅱ分为实验组（anti-IGF-I组）与对照组（control组）。实验组培养介质中加入IGF-I抗体(2μg·ml^-1),对照组不进行任何干预,继续培养48 h后收集细胞待测SP-A/B mRNA表达水平,并观察AEC-Ⅱ的增生情况。结果1不同水平PEEP,iNO和PS对机械通气早产猪肺内GFs和促炎症细胞因子表达的影响1.1不同水平PEEP,iNO和PS对机械通气早产猪肺内GFs mRNA及蛋白表达的影响除NO5、SNO5组,机械通气各组PDGF-B mRNA水平较SB组显著增高（P<0.05）。低PEEP组内,NO5较C5组、SNO5较PS5组表达明显降低（P<0.01）;高PEEP组内,NO10较C10组、SNO10较PS10组表达亦呈降低趋势。高PEEP各组PDGF-B mRNA表达较同一干预的低PEEP组有升高趋势,其中NO5与NO10组、SNO5与SNO10组之间差别有统计学意义（P<0.01）。机械通气各组IGF-I mRNA表达较SB组呈降低趋势,除NO5、SNO5组外差异均有统计学意义（P<0.01）。无论低或高PEEP,NO较C组、SNO较PS组IGF-I mRNA表达呈增加趋势。高PEEP各组较同一干预的低PEEP组IGF-ImRNA表达显著降低（P<0.05）。各组KGF、HGF、VEGF及TGF-β1 mRNA水平趋于一致,组间比较均无明显差异。提示生后早期机械通气6 h（无论低或高PEEP）,早产肺组织中KGF、HGF、VEGF及TGF-β1 mRNA水平未发生明显改变,给予iNO和/或PS干预对其表达亦无显著影响。PDGF-B免疫组化结果显示,NO5、SNO5组阳性细胞分布及染色强度较SB组无明显改变,其余各组阳性细胞数目较SB组增多;C10、PS10组阳性细胞数及染色强度高于NO10、SNO10组。IGF-I免疫组化结果显示,C、PS组阳性表达较SB组呈减少趋势,而C10、PS10组较C5、PS5组减少更为明显;NO、SNO组阳性细胞分布及染色强度较SB组无明显改变。KGF在气道上皮、肺泡上皮及肺间质皆有表达,各组免疫组化结果无明显差别。1.2不同水平PEEP,iNO和PS对机械通气早产猪肺内促炎症细胞因子mRNA表达的影响机械通气各组IL-1βmRNA表达较SB组增高,除NO5和SNO5组外差异均有统计学意义（P<0.01）。低PEEP组内,NO5较C5组、SNO5较PS5组表达明显降低（P<0.01）;高PEEP组内,NO10较C10组（P<0.01）、SNO10较PS10组表达明显降低（P<0.01）。高PEEP各组较同一干预的低PEEP组明显增高（P<0.01）。机械通气各组IL-6 mRNA表达较SB组增高,除NO5和SNO5组外差异均有统计学意义（P<0.05）。低PEEP组内,NO5较C5组呈降低趋势,SNO5较PS5组表达显著降低（P<0.05）;高PEEP组内NO10较C10组、SNO10较PS10组呈降低趋势。高PEEP各组较同一干预的低PEEP组呈增高趋势,其中NO10与NO5组、SNO10与SNO5组间差异有统计学意义（P<0.05）。机械通气各组IL-8 mRNA表达较SB组明显增高（P<0.01）。低PEEP各组间差异无统计学意义;高PEEP组内NO10较C10组、SNO10较PS10组表达明显降低（P<0.05）。C10较C5组、PS10较PS5组呈增高趋势,但差异均无统计学意义。机械通气各组TNF-α较SB组呈增加趋势;两PEEP亚组内及同一干预的高低PEEP组间比较无显著差异。1.3 GFs mRNA水平、促炎症细胞因子mRNA水平、氧合及肺力学参数（第6 h时点）的相关分析IL-1β、IL-6 mRNA表达量与PDGF-B呈正相关（P<0.001）,与IGF-I、PaO₂/FiO₂、Cdyn呈负相关（P<0.001或P<0.05）。IL-8 mRNA表达量与KGF、TGF-β1呈正相关（P<0.001或P<0.05）。IGF-I mRNA表达量与PaO₂/FiO₂、Cdyn呈正相关（P<0.05）。PDGF-B mRNA表达量与PaO₂/FiO₂呈负相关（P<0.001）。KGF mRNA表达量与Cdyn呈正相关（P<0.05）。2小潮气量常规机械通气对足月新生猪和幼猪肺内GFs表达及炎症反应的影响2.1机械通气对肺内GFs表达的影响足月新生猪及幼猪机械通气24 h后,肺内PDGF-B、IGF-I、KGF、HGF、VEGF及TGF-β1 mRNA表达水平较自主呼吸组均无显著差异。2.2机械通气后肺内炎症反应足月新生猪及幼猪机械通气24 h后,肺内MPO含量及IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-αmRNA水平较自主呼吸组均无显著差异。足月新生猪机械通气24 h后W/D较自主呼吸组显著增加（P<0.05）,幼猪机械通气组与自主呼吸组间则无显著差异。2.3机械通气对BALF中磷脂含量的影响足月新生猪机械通气24 h后,BALF中DSPC含量、DSPC/TP比值较自主呼吸组明显降低（P<0.05;P<0.01）;幼猪机械通气24 h后,TPL、DSPC含量较自主呼吸组显著降低（P<0.05）。2.4猪肺发育过程中GFs的表达变化比较不同发育阶段（胎龄97-100天,生后1天,生后4-5周）自主呼吸动物肺组织GFs mRNA的表达水平发现,早产肺组织PDGF-B、IGF-I mRNA水平高于足月新生肺和幼年肺（P<0.01）,足月新生肺及幼年肺间差异无统计学意义。HGF mRNA水平在早产肺和新生肺表达水平高于幼年肺（P<0.05）,早产肺与新生肺间差异无统计学意义。KGF、VEGF、TGF-β1 mRNA水平在上述不同肺发育阶段无明显差别。3促炎症细胞因子对原代培养的新生猪AEC-Ⅱ中GFs mRNA表达水平的影响及意义3.1不同剂量的促炎症细胞因子对AEC-ⅡGFs mRNA表达的影响rhIL-1β和rhIL-6对AEC-ⅡPDGF-B mRNA表达未产生明显影响,但可使IGF-I mRNA表达水平降低。随着rhIL-1β和rhIL-6浓度的增加,IGF-I mRNA表达水平递减,rhIL-1β和rhIL-6对IGF-I mRNA的影响呈现明显的量效关系。rhIL-1β100 ng·ml^-1时,IGF-I mRNA表达较对照组和1 ng·ml^-1组显著减少（P<0.01;P<0.05）。rhIL-6 10 ng·ml^-1时,IGF-I mRNA表达较对照组显著减少（P<0.05）;100 ng·ml^-1时,IGF-I mRNA表达较对照组、1 ng·ml^-1组、10 ng·ml^-1均显著减少（P<0.01）。3.2不同剂量的促炎症细胞因子对AEC-Ⅱ增生及SP-A/B mRNA表达的影响AEC-Ⅱ培养24 h换液后进行第一次细胞计数,加入（实验组）或不加入（对照组）促炎症细胞因子继续培养48 h后进行第二次细胞计数。AEC-Ⅱ增生能力以48 h细胞数量增长倍数（第二次细胞计数/第一次细胞计数）表示。rhIL-1β1ng·ml^-1时,细胞数量增长倍数较对照组略高,但差异无统计学意义;随着rhIL-1β浓度继续增加,细胞数量增长倍数呈递减趋势;rhIL-1β100 ng·ml^-1时,细胞数量增长倍数较对照组和1 ng·ml^-1组均明显减少（P<0.05）。随着rhIL-6浓度的增加,细胞数量增长倍数呈递减趋势。随着rhIL-1β浓度的增加,SP-A mRNA表达水平递减;rhIL-1β100 ng·ml^-1时,SP-A mRNA表达较对照组显著减少（P<0.05）。rhIL-6 1 ng·ml^-1时,SP-AmRNA表达较对照组略高,但差异无统计学意义;随着rhIL-6浓度继续增加,SP-A mRNA表达呈递减趋势;rhIL-6 100 ng·ml^-1时,SP-A mRNA表达较1 ng·ml^-1组显著减少（P<0.05）。各干预组SP-B mRNA表达水平与对照组趋于一致,组间差异无统计学意义。3.3 IGF-I作用途径与AEC-Ⅱ增生、SP-A/B mRNA表达水平的关系AEC-Ⅱ培养24 h换液后进行第一次细胞计数,加入（anti-IGF-I组）或不加入（control组）IGF-I中和抗体继续培养48 h后进行第二次细胞计数,AEC-Ⅱ增生能力以细胞数量增长倍数（第二次细胞计数/第一次细胞计数）表示。anti-IGF-I组细胞数量增长倍数较control组显著减少（P<0.05）。anti-IGF-I组SP-A、SP-B mRNA表达均低于control组（P<0.05）。结论1.生后早期机械通气诱导早产肺促炎症细胞因子（IL-β、IL-6、IL-8及TNF-α）mRNA表达,促进炎症性肺损伤的发生;并增加早产肺PDGF-B mRNA及蛋白表达,抑制IGF-I mRNA及蛋白表达。2.应用恰当的PEEP和iNO降低机械通气早产肺促炎症细胞因子mRNA的表达水平,从而减轻炎症性肺损伤;亦可减轻机械通气对PDGF-B和IGF-I的影响效应,促使其表达接近正常水平。3.IL-1β、IL-6 mRNA表达水平与PDGF-B正相关,与IGF-I负相关,提示炎症性肺损伤过程中PDGF-B及IGF-I表达水平改变可能与IL-1β、IL-6释放增加有关。4.对足月新生猪及幼猪（4-5周龄）应用小潮气量机械通气24均未诱发肺内明显的炎症反应及GFs表达改变。5.早产肺PDGF-B、IGF-I表达水平明显高于足月新生肺及幼年肺,提示两者在晚期胎肺发育阶段可能发挥重要作用。6.体外细胞培养实验显示,促炎症细胞因子rhIL-1β、rhIL-6降低AEC-Ⅱ中IGF-ImRNA表达水平,从而抑制AEC-Ⅱ增生及SP-A mRNA表达,提示IL-1β及IL-6可通过IGF-I作用途径对AEC-Ⅱ的功能产生影响。