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目的: 研究忍冬枝枯病的发病规律和早期检测,探究其对忍冬药材质量的影响,为忍冬枝枯病的防治和药材品质评估提供科学依据. 方法: 大田考察忍冬枝枯病的发病特点;从发病组织及健康组织中分离真菌;利用形态学特征以及rDNA-ITS序列鉴定法,确定菌株的属和种;根据Ceratobasidium theobromae ITS序列以及5个特异基因序列设计特异性引物,对病原菌进行分子检测,并测定引物的灵敏度;用筛选的特异性引物对植物组织基因组DNA进行检验,建立忍冬枝枯病检测体系;调查不同发病程度忍冬植株的金银花产量,并按照2015版《中华人民共和国药典》方法规定用高效液相法测定金银花中绿原酸和木犀草苷的含量以及忍冬藤中绿原酸和马钱苷的含量. 结果: 1.忍冬枝枯病发病规律 7~9月份是枝枯病的高发期,受枝枯病危害的忍冬在次年3月底4月初的发芽期,枝条不发芽或者新芽的数量较少,且整株树的长势也相对较弱.在花期,发病植株现蕾的时间比健康植株晚7~9天,花的产量也会受到相应的影响.对田间采集枝枯病病枝进行高温高湿培养,发现当年5月中下旬才开始产生菌丝,会一直延续到12月份.高温潮湿的环境下,田间枝条、叶片伤口以及落叶叶痕处均会出现白色菌丝.早期菌丝呈白色蓬松絮状,之后会慢慢聚集成浅黄色硬块.发病枝条叶片褪绿变黄干枯一般从枝条下端往上端发展,早期叶片叶肉褪绿变黄,叶脉显绿色,呈鱼骨纹状花纹,由叶尖或叶缘向里逐渐干枯直至干枯脱落.每层叶片从褪绿变黄到干枯27天左右,一层叶片褪绿变黄到下一层叶片开始表现出发病症状大概7~9天.主枝叶片从开始发病到全部干枯脱落需要50~72天,侧枝从第27天左右开始表现出褪绿症状,第80天左右叶片全部干枯脱落. 2.忍冬植物组织菌株的分离与鉴定 对忍冬健枝、健叶、病枝、病叶4个部位进行菌株分离,分别获得真菌13株、16株、28株、57株.根据菌株形态学和显微特征进行分类,总计12个属,113株.利用ITS1/ITS4引物对各属代表菌株进行PCR扩增,克隆测序,鉴定共得到15种真菌,分别为瓜笄霉(Choanephora cucurbitarum)、米根霉(Rhizopus oryzae)、变红镰刀(Fusarium incarnatum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、苹果轮纹(Botryosphaeria dothidea)、毛霉(Mucor ellipsoideus)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、穗状弯孢(Curvularia spicifera)、厚孢镰孢(Fusarium chlamydosporum)、拟茎点霉菌(Phomopsis capsici)、菜豆间座壳(Diaporthe phaseolorum)、细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)、粪生粪壳菌(Sordaria fimicola)、轮枝样镰刀菌(Fusarium verticillioides)、可可瘤肿担子菌(Ceratobasidium theobromae). 3.忍冬枝枯病特异性引物的设计与筛选 本研究对文献报道及自行设计共13对引物进行了特异性验证,经过反应条件的优化,结果只有Th-t02.0406F/R、Th-t07.0104F/R、Th-t09.0300F/R、Th-t80.0268F/R、Th-t02.0204F/R5对引物具有特异性,特异性扩增产物大小分别为587bp、645bp、813bp、1271bp、253bp. 4.忍冬枝枯病病菌引物灵敏度检测 应用Th-t02.0406F/R、Th-t07.0104F/R、Th-t09.0300F/R、Th-t80.0268F/R、Th-t02.0204F/R5对特异性引物对忍冬枝枯菌DNA灵敏度和植物组织DNA灵敏度进行检测.引物Th-t80.0268F/R和Th-t02.0204F/R对枝枯菌DNA灵敏度最高,可以检测到的最小DNA浓度为9.765×10-3ng/μL.引物Th-t09.0300F/R可以检测到的忍冬枝枯病病菌最小DNA浓度为9.765×10-2ng/μL,引物Th-t02.0406F/R可以检测到的忍冬枝枯病病菌最小DNA浓度为9.765×10-1ng/μL,引物Th-t07.0104F/R可以检测到的忍冬枝枯病病菌最小DNA浓度为9.765×10-2ng/μL.引物Th-t02.0204F/R最低可以从叶和茎中检测到菌丝含量为150mg/g.引物Th-t80.0268F/R最低可以从茎中检测到的菌丝含量为150mg/g,叶中含量为500mg/g.引物Th-t02.0204F/R可作为植株枝枯菌检测的特异性引物. 5.忍冬枝枯病不同等级对金银花产量的影响 各等级忍冬植株的结蕾量差异极显著,0级植株平均单株结蕾量最多,达216枚,7级植株平均单株结蕾量最少,只有68枚.植株的结蕾量随着发病等级的增加而减少,发病越重,结蕾量越少.1、3、5、7级植株的平均单株产量均显著低于0级植株.0级植株平均单株产量最高,干重达34.19g;7级植株平均单株产量最低,仅有6.13g,约为0级植株产量的1/6,差异极其显著. 6.金银花和忍冬藤质量检测 各病级忍冬植株金银花样品绿原酸和木犀草苷以及忍冬藤样品绿原酸和马钱苷的含量均达到药典标准.金银花中绿原酸的质量分数为2.31%~3.46%,其中1级病树金银花中绿原酸的含量最高,健株(0级)金银花中绿原酸的含量最低.各发病等级植株金银花中绿原酸含量均高于健株,差异极显著(P＜0.01).金银花中木犀草苷的质量分数为0.050%~0.065%,健株金银花中木犀草苷的含量最低.健株和其他各发病等级植株金银花中木犀草苷含量差异极显著(P＜0.01).忍冬藤中绿原酸的质量分数为0.43%~0.54%,健康植株忍冬藤中绿原酸的含量高于其它各发病等级植株,差异极显著(P＜0.01).忍冬藤中马钱苷的质量分数为0.82%~1.58%,各发病等级植株忍冬藤中马钱苷含量均低于健康植株,差异极显著(P＜0.01). 结论: 1.通过田间调查掌握了忍冬枝枯病的发病规律,可以为枝枯病的田间防治提供指导. 2.通过特异引物筛选和灵敏度检测,建立了枝枯病菌的PCR检测体系. 3.忍冬枝枯病的发生,有利于金银花中绿原酸、木犀草苷的积累,但会显著降低金银花的产量以及忍冬藤中绿原酸和马钱苷的含量,导致忍冬藤药材质量下降,因此需要重视忍冬枝枯病的防治.各病级忍冬植株金银花样品绿原酸和木犀草苷以及忍冬藤样品绿原酸和马钱苷的含量均达到药典标准.