论文部分内容阅读
本文选择荧蒽(Fluoranthene, FL)作为多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)的代表,进行衍生化,合成半抗原;选择酮洛芬(Ketoprofen, KET)作为非甾体抗炎药(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)的代表,可直接作为半抗原。将他们分别与两种载体蛋白偶联合成人工抗原。用合成的免疫原免疫大白兔,制备出高效价的抗FL抗体、抗KET抗体。分别以抗FL抗血清、抗KET血清为核心建立了检测荧蒽、酮洛芬的间接竞争酶联免疫吸附测定法(ic-ELISA法)。主要研究结果如下:1.荧蒽和酮洛芬人工抗原的合成及鉴定采用活化酯法,将荧蒽、酮洛芬分别与牛血清白蛋白(BSA)偶联,制得免疫原FL-BSA、KET-BSA;用混合酸酐法将两种物质分别与OVA偶联,制备包被原FL-OVA、KET-OVA。经过彻底透析后,通过紫外进行鉴定,紫外扫描图谱显示人工抗原合成成功。用考马斯亮蓝法计算出偶联物FL-BSA、KET-BSA、FL-OVA、KET-OVA的浓度分别为3.95 mg/mL、5.25 mg/mL、5.95 mg/mL、4.28 mg/mL,并计算其偶联比分别是16: 1、10: 1、13: 1、9: 1。2.多克隆抗体的制备及效价的测定用免疫原FL-BSA、KET-BSA分别免疫大白兔,制备出两种血清:抗FL血清、抗KET血清。抗FL抗体、抗KET抗体的最高效价分别为6.4×104、1.28×105。3.间接竞争酶联免疫吸附测定法(ic-ELISA法)的建立通过对检测步骤、检测条件等因素进行优化,得到ELISA检测方法的灵敏度、线性范围、标准曲线。结果显示较合适的检测条件为:FL、KET包被抗原浓度为1:2000,抗FL抗体、抗KET抗体使用浓度均为1:8000;最佳包被时间均为4℃,过夜;最佳封闭液均为0.5%明胶;最佳封闭时间均为1.0 h;一抗最佳作用条件均为37℃,60 min;二抗最佳作用条件均为37℃,60 min。用优化后的ic-ELISA检测法,建立标准曲线:FL标准曲线,线性范围为10 ng/L~10μg/L,IC50是0.142 ng/mL,最低检测限(LOD)为2.01 ng/L,回归方程为y=-21.64x+96.55 (R2=0.960),与结构类似物交叉反应率较低;KET标准曲线,线性范围为10 ng/L~10μg/L,IC50是0.235 ng/mL,最低检测限为4.26 ng/L,回归方程为y=-22.97x+104.46(R2=0.980),与结构类似物交叉反应率较低。两种物质所建立的方法的批内Cv及批间Cv均在10%以内,符合方法所需的精密度要求。4.实际样品的测定建立HPLC测定两种物质的标准曲线:FL的回归方程为y=35126.00x+5363.46(R2=0.999);KET的回归方程为y=41440.05x+3563.48(R2=0.998)。以建立的ELISA检测方法及HPLC对添加在水样中的样品进行回收,测定FL、KET在水样中的添加回收率为88%~110%,三个平行的变异系数在2%~8%之间;用建立的ic-ELISA法测定实际水样中的FL、KET,并与HPLC方法进行比较,均有不同程度的荧蒽及酮洛芬检出。综合分析,本文成功的制备了FL及KET的人工抗原,经动物免疫获得了高效价的抗血清,可用于建立FL、KET的间接ELISA方法。经优化,建立了FL、KET的标准曲线,与结构类似物的交叉反应不明显,可以用于含有FL、KET的环境样品的初筛选,为研究和开发FL、KET的ELISA试剂盒奠定了基础。