褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)是水稻的主要害虫之一,它通过口针鞘取食水稻韧皮部,影响水稻的生长和发育。大量褐飞虱取食会引起水稻的叶片干枯,分蘖萎,形成飞虱火烧。但是一直以来,我们对水稻如何通过自身的先天免疫系统(innate immune system)防御褐飞虱取食的分子机理知之甚少。在之前的研究中我们通过抑制差减杂交(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)的方法,在感虫品系Minghui 63中得到一个受褐飞虱取食诱导的单拷贝基因Bphi008a,其表达亦可以被机械伤害以及外源乙烯利所诱导,同时对外源的SA、MeJA和ABA的诱导无反应。通过构建该基因的超量表达(Overexpression,OE)和抑制(double-stranded RNA interference,RNAi)转基因植株,我们对Bphi008a基因的功能进行了系统的研究。转基因后代的Northern分析显示,OE群体中在未受到褐飞虱取食的情况下该基因表达得到明显的上调；RNAi群体中在褐飞虱取食48h后该基因表达仍然比对照中还要低。Southern分析显示,在OE群体的T1代,我们得到一个Bphi008a基因单拷贝插入的纯合群体OE21-15。借助苗期集团法、蜜露量鉴定以及电子刺吸仪(Electronic Penetration Graphs, EPG)技术等方法的结合,我们发现在褐飞虱取食7天后,OE群体的抗性相比WT群体而言有明显的提高,而RNAi群体相比WT群体而言,其抗性只是得到略微的下调。洋葱表皮定位实验显示Bphi008a蛋白具有细胞膜和细胞核双向定位,并且Bphi008a蛋白N端的20个氨基酸对其细胞膜定位具有非常关键的作用。我们发现该基因在苗期的根部表达量最高,其次在穗期叶片、穗期叶鞘、苗期叶鞘、苗期叶片和苗期根部也有比较高的表达,在穗期的小花中我们基本检测不到该基因的表达。通过Real-time PCR方法,我们首先对褐飞虱取食叶鞘(6h、12h,24h、48h、72h和96h)后10对最常用的内参基因进行稳定性的分级,在WI、OE、RNAi和1-MCP处理WT群体中分别确立最稳定的看家基因组合,以保证后续基因表达结果的稳定性和可靠性。乙烯合成酶(OsACS)和乙烯氧化酶(OsACO)基因家族的表达结果显示,褐飞虱的取食是一个迅速开启水稻体内乙烯合成的过程；联合1-MCP(乙烯竞争性抑制剂)处理的结果,我们认为Bphi008a基因是一个乙烯信号途径下游的效应基因。体外磷酸化实验证实Bphi008a蛋白能够被OsMPK5蛋白磷酸化,并且磷酸化位点位于其C末端多脯氨酸区域。酵母双杂交和拟南芥原生质体BiFC实验证实Bphi008a蛋白与OsMPK5蛋白互作,并且这种互作发生在细胞核中。结合体外和体内实验的结果,我们认为翻译后产生的Bphi008a蛋白在细胞核中经历了磷酸化的调控。随后的Real-time PCR结果显示,四个受到外源乙烯利和稻瘟病处理表达上调的水稻MAPK家族成员OsMPK5、OsMPK12、OsMPK13和OsMPK17的表达在转基因群体中呈现不同的差异,这意味着磷酸化后的Bphi008a蛋白介导的抗虫可能与水稻MAPK信号途径介导的先天免疫性相关。后续的实验发现在超量表达群体里面,两个属于AP2/ERF转录因子家族、受到OsMPK5/12直接磷酸化激活的转录因子OsERF1和OsEREBP1的表达水平明显提升；并且同时我们也发现几个特异作用于植食性昆虫肠道、干扰昆虫消化过程的蛋白酶抑制剂基因的表达在转基因和WT植株中呈现不同的表达差异,如Arginase、CysPI以及LEA2等等。最后通过酵母双杂交筛库的结果,我们发现Bphi008a能够和bZIP型转录因子OsbZIP60以及一个RNA聚合酶的多肽SDRP互作。总结以上研究结果,我们认为来源于乙烯信号途径的基因Bphi008a,在植物体内被磷酸化后通过和OsbZIP60以及SDRP互作组成一个转录复合体来调控一系列OsMPKs基因的表达,并最终提高水稻对褐飞虱的抗性。