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脑胶质瘤,亦称为神经胶质细胞瘤,发生于神经外胚层,是颅内最常见的原发性肿瘤,约占全部颅内原发肿瘤的36.26%～60.96%。脑胶质瘤尤其是高级别胶质瘤具有异常增生、浸润性生长、易复发、血管异常增生及免疫耐受等生物学特性,这使得胶质瘤虽经不断改进的显微外科手术切除、放射治疗、化学治疗等措施的综合处理,仍易复发,预后不尽人意。如胶质母细胞瘤(Glioblastoma, GBM)患者虽经过综合治疗后,其中位生存时间仍少于15个月。为此临床需要寻找治疗胶质瘤的新方法。最近的研究证实,同种异体NK细胞能有效地杀伤原代的鼻咽癌、胃癌、肾癌、肠癌和卵巢癌等肿瘤细胞。NK细胞对靶细胞的杀伤活性与NK细胞表面的受体和靶细胞表面的配体之间的相互作用密切相关。NK细胞表面的杀伤抑制受体与靶细胞表面的HLA-I类分子的结合,抑制NK细胞对靶细胞的杀伤,而当靶细胞缺乏HLA-I类分子时可激发NK细胞对靶细胞的杀伤作用。NKG2D(natural killer group 2D)是NK细胞表面的主要杀伤活化受体,其配体为MHC-Ⅰ类链相关分子(MHC classⅠchain-related molecule, MIC) A和B及人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白(UL16 binding proteins, ULBP)1、2和3等。本研究关注的是同种异体的NK细胞是否具有杀伤胶质瘤细胞的效应。在体外条件下分离、培养人脑胶质瘤细胞(human glioma cell, HGC),观察其生物学特性,检测其HLA-Ⅰ类分子和NKG2D配体的表达,并在体内、外条件下观察同种异体NK细胞杀伤胶质瘤细胞的可行性及其分子基础,为进一步认识同种异体NK细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用提供实验和理论基础。从而为胶质瘤的治疗探索新的方法。第一部分原代培养HGC的生物学特性研究目的：原代分离、培养、鉴定HGC,并观察其生物学特性,为探讨同种异体NK细胞对HGC的杀伤效应提供必备的基础。方法：术中获取胶质瘤患者肿瘤组织标本(术后病理诊断为胶质瘤Ⅳ级),分离、培养得到HGC,并经GFAP免疫组织化学鉴定为HGC。镜下观察胶质瘤细胞生长特点,并将一定剂量的HGC注入BALB/c裸鼠体内,观察移植HGC成瘤特征。结果：1.显微镜下观察肿瘤组织HE染色切片见：核浓染,异形性明显,可见巨核,核分裂等。判定培养细胞来源的组织为胶质瘤Ⅳ级。2.体外培养的HGC生长良好,群体倍增时间为23.48hr。传代后的细胞生长旺盛,状态良好,性状稳定,有明显的对数生长期。3.培养的HGC经HE染色显示：细胞呈梭形、星形或不规则形,突起较小,核大小不一。免疫细胞化学结果显示：绝大多数细胞GFAP呈阳性反应。4.将0.1ml (1×106个) HGC的悬液移植入BALB/c裸鼠体内,肿瘤出现时间为(9.17±1.68)d,成瘤率为100%,瘤组织为胶质瘤Ⅳ级。结论：1.HGC可以在体外进行培养,细胞倍增时间为23.48hr。2.胶质瘤细胞可成瘤,肿瘤出现时间约为(9.17±1.68)d。第二部分HGC HLA-I类分子和NKG2D配体表达的检测目的：检测原代培养的HGC HLA-I类分子和NKG2D配体表达情况,为进一步认识同种异体NK细胞对胶质瘤细胞的杀伤作用提供实验和理论基础。方法：采用RT-PCR的方法检测HGC MICA、MICB、ULBP1、ULBP2及ULBP3在mRNA水平的表达；采用流式细胞技术检测MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3分子及HLA-I类分子的表达；采用Western Blot技术检测MICA.ULBP2及ULBP3蛋白的表达。结果：1. RT-PCR检测结果显示HGC在mRNA水平表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3。2.流式细胞仪检测结果证实HGC表面表达HLA-I类分子及NKG2D的配体MICA、ULBP2和ULBP3,不表达NKG2D的配体MICB及ULBP1。3. MICA、ULBP2、ULBP3和HLA-I类分子在HGC的表达的阳性百分数分别为63.26±6.71%、61.234±5.97%、51.47±2.43%和89.67±7.28%。4. Western blot检测结果证实胶质瘤细胞表而表达NKG2D的配体MICA、ULBP2和ULBP3分子。结论：1.HGC在mRNA水平表达NKG2D的配体ULBP1、ULBP2、ULBP3、MICA和MICB。2.HGC表面表达MICA、ULBP2及ULBP3分子,不表达MICB和ULBP1分子。3.HGC表面高表达HLA-I类分子。第三部分同种异体NK细胞对HGC体外杀伤效应的实验研究目的：检测同种异体NK细胞对HGC的杀伤效应。方法：采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,并通过MACS纯化NK细胞；采用MTT方法检测同种异体NK细胞对HGC杀伤效应,及不同效靶比时NK细胞对HGC的杀伤活性。结果：1.分离、纯化的阳性部分中,CD3-CD16+CD56+细胞的纯度达91.7%。2.同种异体NK细胞对HGC具有杀伤活性,且杀伤效应随着效靶比的升高而增强；效靶比为10∶1、20∶1、50∶1和100∶1时,杀伤活性分别为：23.64±1.73%、37.28±3.67%、49.63±4.28%和74.16±6.43%。结论：1同种异体NK细胞对HGC具有杀伤活性。2 HLA-I类分子及MICA、ULBP2及ULBP3分子在NK细胞对HGC的杀伤效应中起重要作用。第四部分同种异体NK细胞对HGC裸鼠皮下移植瘤的抑制作用目的：观察同种异体NK细胞在BALB/c裸鼠体内对HGC的杀伤效果,为脑胶质瘤免疫治疗提供实验和理论基础。方法：BALB/c裸鼠32只,随机分为4组：A组：无细胞移植组；B组：HGC移植组；C组：HGC+NK细胞移植治疗组；D组：单纯NK细胞移植组,每组8只。观察各组裸鼠成瘤时间、肿瘤体积变化,绘制肿瘤生长曲线、计算成瘤率。成瘤3周后,处死裸鼠,取瘤块称重,计算肿瘤生长抑制率,肿瘤组织常规病理检查。结果：1.A组和D组无肿瘤生长,B组和C组肿瘤出现时间分别为(9.23±1.64)d和(15.26±1.53)d。2.生长曲线显示同种异体NK细胞能明显减缓移植入BALB/c裸鼠体内的HGC的生长速度。B组和C组裸鼠的瘤体重量分别为(1.74±0.13)g和(1.26±0.08)g,C组瘤体较B组瘤体明显减小,肿瘤生长抑制率为27.59%。3.成瘤组织经HE染色鉴定为胶质瘤Ⅳ级,C组瘤体HE染色切片可见较多的坏死肿瘤细胞和NK细胞浸润。结论：同种异体NK细胞能有效抑制移植到裸鼠体内的HGC的生长。