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研究目的:本研究旨在总结中国肌萎缩侧索硬化(amytrophic lateral sclerosis,ALS)患者重复神经刺激(repetitive nerve stimulation,RNS)的特点,期望有新的发现并探讨其与疾病发病的关系及可能的机制。研究方法:1.收集诊断ALS(临床可能的ALS除外)并行RNS的病例,共纳入149例,对其临床及神经电生理资料进行回顾性研究。2.所有病例均行针极肌电图(electromyography,EMG)和重复神经刺激。低频RNS(3Hz)检查神经包括:副神经、腋神经、尺神经、股神经、腓总神经、面神经以及正中神经。仅部分病例行尺神经高频RNS(20Hz)。3.运用SPSS 22.0进行T检验及卡方检验等统计学分析。研究结果:1.研究纳入的患者确诊年龄范围为22-78岁,平均年龄54.5±10.8岁。男女比例为 1.6:1。2.至少1根神经出现低频RNS波幅递减(≥10%)见于56.4%(84/149)患者,最常见于支配近端肌肉的神经如副神经及腋神经。其余神经低频RNS波幅递减较少见。面神经未出现低频RNS波幅递减。3.在6.5%行尺神经高频RNS的患者(7/108)中,高频RNS出现波幅递增(≥60%),其中5例同时有副神经低频RNS波幅递减。4.109根出现低频RNS波幅递减的神经中,呈现CMAP波幅持续性递减的波型占多数(56.9%,62/109),多于呈现U型波幅回升的波型(34.9%,38/109)及不典型波型(8.2%,9/109)。5.19例低频RNS示副神经波幅递减,但副神经所支配的胸锁乳突肌EMG正常,且神经系统查体中未发现胸锁乳突肌力弱。其中3例合并有尺神经高频RNS波幅递增。结论:1.ALS患者神经电生理检查中低频RNS波幅递减较常见,尤其常见于副神经和腋神经。2.胸锁乳突肌EMG、肌力正常的患者出现副神经低频RNS波幅递减提示神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)的损害有可能早于前角神经元的丢失。3.高频RNS波幅递增以及主要为持续递减而不是U型回升的波型提示突触前膜及后膜均有损害。可以推断,ALS患者的NMJ损害包含整个突触结构,而非局限于某一区域。研究目的:本研究以一家族性ALS(FALS)家系为基础,发现一个新基因可能为ALS的致病基因——ETV1基因。为此,我们构建了 ETV1-D38G转基因小鼠模型,通过对其一般状况及行为学试验的观察、神经电生理的检测、神经肌肉病理的研究、转录组测序等,旨在了解ETV1基因突变与ALS表型的关系。研究方法:1.前期构建的ETV1-D38G杂合转基因小鼠杂交产生子代小鼠,21天断乳后剪取鼠尾,提取DNA,通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳,确定子代小鼠基因型。测序确定突变位点存在。将所得雄鼠分为纯合组、杂合组和野生对照组。所有小鼠均在符合SPF级标准的环境下饲养。2.实验组小鼠每组10只,从出生后60天开始,观察其一般情况,测量体重,并利用转棒试验、悬尾试验等行为学试验检测其运动功能,记录其生存期。另外,实验组纯合及野生对照小鼠各1只麻醉后行腓肠肌针极肌电图检查,观察运动单位电位及是否有异常自发电位。3.实验组纯合及野生对照小鼠各1只断颈处死后,取腰膨大段新鲜脊髓及腓肠肌,中性福尔马林固定,石蜡包埋后切片,行HE染色及尼氏染色(肌肉仅行HE染色)。光学显微镜下观察脊髓、肌肉形态及脊髓前角神经元数量及形态。脊髓同时行GFAP免疫荧光染色和泛素免疫组化染色,观察是否出现胶质增多现象及泛素阳性包涵体。4.纯合转基因小鼠及野生对照小鼠各3只断颈处死后,取整条新鲜脊髓组织提取总RNA,通过RNA质量检测、转录组测序文库制备、库检、成簇与测序等步骤进行转录组测序,用DAVID软件进行结果分析。观察目的基因突变对小鼠基因表达的影响。5.运用SPSS 22.0进行正态分布检验和T检验等统计学分析。研究结果:1.经鉴定,最后共获得实验雄鼠:纯合19只,杂合27只,野生对照15只。2.通过观察一般情况、体重及各项行为学试验的,转基因小鼠与野生对照组小鼠未发现明显差异,生存期正常。实验鼠行针极肌电图检查,未发现异常自发电位,运动单位电位波幅、时限无统计学差异。3.实验组鼠脊髓和肌肉的HE染色和脊髓尼氏染色、GFAP免疫荧光、泛素免疫组化结果显示,与野生对照组小鼠无明显差异。4.RNA测序显示,24个基因表达水平有变化(FDR≤0.5),其中12个基因表达水平有显著变化(FDR≤0.1)。表达变化的基因数目较少,且与ALS疾病关联不明显。可以认为未发现有意义的信息。结论:1.通过生存期、行为学试验、神经电生理、神经病理、转录组测序的研究,ETV1-D38G转基因小鼠纯合组、杂合组与野生度对照组小鼠未出现明显差异。目的基因与ALS疾病发生的关联不明确。2.转基因小鼠模型未出现表型,分析原因可能为:环境因素干扰;动物模型与人类疾病表现一致性不高;家系携带ETV1-D38G基因突变以外,还存在ATXN3异常扩增,因此我们考虑此家系为ALS和SCA3共病,SCA3本身与多种神经系统变性存在交叉,家系中ALS的发病,有可能并非ETV1基因突变的单独作用,而可能是与ATXN3基因的异常扩增共同作用,寡基因致病机制不可忽视。3.下一步可以选择ETV1-D38G转基因小鼠与SCA3小鼠杂交后,得到含有两种基因突变的“double hit”小鼠,并观察其与SCA3小鼠、野生小鼠的差异,进一步了解目的基因与疾病的关系。