短蛸(Octopus ocellatus)是我国沿海地区重要的经济品种,针对日益严峻的水产养殖形势和海洋生态问题,迫切需要从分子水平了解短蛸免疫机制,探讨提高其抗病力的途径,改进种质资源的品质,为海洋生态和水产养殖的可持续发展提供理论支持。短蛸缺乏获得性免疫,在抵御微生物侵袭时主要依赖固有免疫系统。溶菌酶作为重要的免疫效应因子,在机体免疫防御反应中可以直接抵抗病原微生物,也可以诱导机体合成和分泌其他免疫因子。溶菌酶通过水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键裂解不溶性的肽聚糖,使细菌细胞壁破裂起到杀菌作用。依据来源和结构的不同将溶菌酶分为六大类型:c型、g型、植物型、细菌型、噬菌体型和i型,其中i型溶菌酶作为无脊椎动物所特有的一种溶菌酶主要分布在环节动物门、棘皮动物门、软体动物门和节肢动物门中。本研究以课题组已构建的短蛸c DNA文库为基础,运用现代分子生物学技术克隆获得短蛸i型溶菌酶(Oo Lys)基因;对该基因序列进行了生物信息学分析;检测了Oo Lys在短蛸各组织及其受到鳗弧菌和藤黄微球菌刺激后在血细胞中的表达规律;利用DNA重组技术构建了以大肠杆菌BL21(DE3)为表达载体的原核表达系统,体外表达了短蛸重组溶菌酶蛋白(r Oo Lys);利用分子生物学和免疫生物学方法对r Oo Lys进行了活性分析;旨在探索Oo Lys在短蛸的免疫防御反应中的功能及其作用机制,为海洋贝类免疫学的发展提供理论支持。本研究扩增获得了Oo Lys基因的c DNA全长,其全长为678 bp,包括5’的非编码区(UTR)156 bp,3’UTR 111 bp,3’端有poly A尾巴和多聚腺苷酸加尾信号AATAAA,开放阅读框(ORF)411 bp,编码137个氨基酸,经预测其等电点为8.15,分子量为15.36 k Da,其氨基酸序列1(M)—18(A)是信号肽,19(A)—135(K)是Destabilase结构域。同源性、系统进化树和三维结构分析发现:Oo Lys与菲律宾蛤仔、文蛤、冰岛扇贝、贻贝等双壳贝类的亲缘关系最近,聚首在软体动物门,有Glu(40)、Glu(49)和Ser(52)三个保守的酶活中心和12个保守的半胱氨酸残基,形成4对二硫键,蛋白质构象非常稳定;隶属于i型溶菌酶。应用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测了Oo Lys在短蛸各组织内的表达规律,结果表明在血细胞、肌肉、鳃、肝胰腺、肾囊、外套膜、胃、鳃心、系统心脏和性腺中均有表达,在肝胰腺中的表达最高,是在性腺中表达量的310倍,在性腺中表达量最低。经鳗弧菌和藤黄微球菌的刺激后,Oo Lys在血细胞中的表达量出现明显的被诱导表达趋势;在鳗弧菌和藤黄微球菌的刺激后6 h均出现第一次上调,分别升高到对照组的7.3倍和4.3倍,Oo Lys可能参与了机体的急性应激反应。鳗弧菌刺激后48 h的表达量达到峰值。藤黄微球刺激在24 h出现第二次表达上调,提示Oo Lys可能参与了机体对细菌的清除过程。将Oo Lys编码区成熟肽克隆入p EASY-E1表达载体中,经转化导入大肠杆菌BL21(DE3)表达系统中,利用1‰的IPTG诱导表达。镍螯合琼脂糖凝胶色谱法分离含有His-Tag标签的重组蛋白,并利用梯度稀释法逐级降低变性剂尿素的浓度对重组蛋白进行复性。利用比浊法检测了r Oo Lys和热处理的r Oo Lys对革兰氏阳性菌藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌大肠杆菌、鳗弧菌和的溶菌活性,以及r Oo Lys的胞壁酸酶活性。实验结果表明:r Oo Lys对革兰氏阳性菌和阴性菌均有溶菌活性,但是对阳性菌的溶菌活性更强;抗血清孵育后,r Oo Lys对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑菌效果均受到抑制;经r Oo Lys热处理后,对阴性菌具有抑菌效果,对阳性菌失去作用,表明其对革兰氏阴性菌的抑菌作用通过酶途径和非酶途径两种方式进行,而对阳性菌的抑菌作用则主要依赖酶活性;以阳性菌细胞壁的主要成分肽聚糖为反应底物,加入r Oo Lys后测定吸光值的变化,吸光值显著降低,证实了r Oo Lys具有胞壁酸酶活性,通过破坏肽聚糖的β-1,4-糖苷键裂解细菌细胞壁,达到溶菌的效果,揭示了r Oo Lys抑菌作用的机制。以比浊法和扫描电镜法检测了r Oo Lys对鳗弧菌的作用效果,结果表明:r Oo Lys实验组的OD600值在孵育4 h后明显低于PBS和等质量浓度Amp对照组;扫描电镜观测到在鳗弧菌与r Oo Lys作用后,与PBS对照组相比鳗弧菌发生了严重的变形,表面粗糙甚至破损;以上结果证明r Oo Lys对鳗弧菌具有良好的抑菌效果,为r Oo Lys应用于实际生产提供了理论支持。综上所述,本研究克隆得到了一个短蛸i型溶菌酶Oo Lys;并分析了其m RNA的规律和其编码蛋白的特性;证实了Oo Lys参与短蛸抵御革兰氏阴性菌和阳性菌的免疫反应;r Oo Lys对多种细菌具有溶菌活性,且对阴性菌的抑菌作用通过酶活和非酶两种途径进行;证明了r Oo Lys具有胞壁酸酶活性。研究结果揭示了短蛸溶菌酶Oo Lys在其免疫防御中发挥的作用,为进一步了解短蛸免疫机制,探讨提高其抗病力的途径提供了理论参考。