目的：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，其发病率已跃居女性恶性肿瘤的第一位。最新统计报告显示，全球乳腺癌的发病率和死亡率逐渐上升，年死亡人数大约40万人。因此，进一步研究乳腺癌的发生、发展机制具有重要意义。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）属于酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase，RTK）家族，包括erbB-1/EGFR、erbB-2/HER-2、erbB-3和erbB-4四个成员，其在细胞的增殖、分化、迁移和存活中发挥重要作用，它们的调控异常与肿瘤的发生、发展有密切的关系。已有报道，HER-2基因扩增和/或蛋白过度表达与乳腺癌的增殖和浸润密切相关，目前已经公认HER-2表达与否是判断乳腺癌预后的一个重要指标。HER-2形成二聚体后，分子中酪氨酸磷酸化可使受体活化，进而激活细胞内一系列信号转导通路，参与肿瘤细胞的增殖和分化等。目前针对HER-2的分子靶向药物已经用于临床治疗乳腺癌，但其单独应用有效率非常低，提示在HER-2过表达的乳腺癌中可能还有其它的分子在HER-2启动的致癌信号通路中发挥重要作用。因此，探索更为有效的乳腺癌治疗新靶点具有重要的意义。有研究发现EGFR也是一种与乳腺癌预后不良相关的标志性分子。EGFR在大约35%～50%的乳腺癌组织中过表达，在三阴性乳腺癌（triplenegative breast cancers，TNBC）中的表达率约为60%。当EGF与EGFR结合后，通过受体二聚体化和相互磷酸化激活受体蛋白激酶，导致胞内酪氨酸激酶区域上的酪氨酸磷酸化，进而激活MEK/ERK及其下游信号传导通路，促进乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。通过阻断EGFR启动的信号通路将有助于抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移。小凹蛋白-1（caveolin-1）是膜内陷囊泡（caveolae）的标志性结构蛋白，它广泛参与细胞的多种生命活动，主要通过磷酸化/去磷酸化途径与多种信号分子相互作用，调控细胞的转化、增殖、迁移和浸润等。已有研究证明，Caveolin-1可直接与EGFR结合并抑制其磷酸化。是否Caveolin-1能直接与HER-2结合并抑制其磷酸化？目前尚未见报道。本研究拟在培养的乳腺癌细胞中，进一步探讨Caveolin-1调控EGFR、HER-2磷酸化（活化）及其下游信号通路对乳腺癌细胞增殖的影响。方法：1细胞培养用含有10%胎牛血清（FBS）、青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml的1640培养基，在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞。2明胶酶谱法检测不同乳腺癌细胞的侵袭能力培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞，24小时内待细胞长满至培养皿的80%-90%，用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养24小时，收集上清，应用明胶酶谱法测定不同乳腺癌细胞中MMP2、MMP9蛋白的活性，了解不同乳腺癌细胞的侵袭能力。3细胞划痕修复实验检测不同乳腺癌细胞的迁移能力培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞，待贴壁细胞密度为90%左右，饥饿培养细胞4小时，用无菌200ul移液器吸头在培养皿底部划一条直线，分别于6小时和12小时后观察划痕愈合宽度的变化，计算细胞迁移率。4Western Blot检测不同乳腺癌细胞Caveolin-1、EGFR、HER-2蛋白的表达培养乳腺癌MDA-MB-453、MDA-MB-436、SKBR-3细胞，待细胞长满至培养皿的80%左右，用无胎牛血清的1640培养基饥饿培养4小时，收集细胞提取总蛋白，采用免疫印迹（Western Blot）法测定不同乳腺癌细胞中Caveolin-1、EGFR、HER-2蛋白的表达情况。5激光共聚焦显微镜观察Caveolin-1和EGFR在乳腺癌细胞中的定位培养乳腺癌MDA-MB-436细胞，用带有红色荧光羊抗鼠IgG和绿色荧光羊抗兔IgG的荧光二抗，进行免疫细胞荧光染色，激光共聚焦显微镜下观察Caveolin-1和EGFR蛋白在乳腺癌MDA-MB-436细胞中的定位。6沉默或过表达Caveolin-1对乳腺癌细胞EGFR、HER-2、ERK磷酸化水平的影响培养乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3、MDA-MB-436细胞，用Lipofectamine2000进行Caveolin-1pcDNA或Caveolin-1siRNA质粒转染，观察Caveolin-1过表达或沉默Caveolin-1对乳腺癌细胞表皮生长因子受体磷酸化水平的影响。实验分组：乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3细胞分为Caveolin-1pcDNA转染组和pcDNA3.1转染组；乳腺癌MDA-MB-436细胞分为Caveolin-1siRNA转染组和阴性对照Shut1转染组。每组分别于EGF刺激0min、5min、10min、30min后收集细胞，提取蛋白，Western-blot检测各时间点Caveolin-1、HER-2、p-HER-2、EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK蛋白的表达。7MTT比色分析法检测Caveolin-1对乳腺癌细胞增殖的影响培养乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3、MDA-MB-436细胞，用Lipofectamine2000进行Caveolin-1pcDNA或Caveolin-1siRNA质粒转染，MTT法检测细胞增殖水平。实验分组：乳腺癌MDA-MB-453、SKBR-3细胞分为Caveolin-1pcDNA转染组和pcDNA3.1转染组；乳腺癌MDA-MB-436细胞分为Caveolin-1siRNA转染组和阴性对照Shut1转染组。每组分别于100nM的EGF刺激细胞24小时后，用MTT比色分析法检测乳腺癌细胞的增殖水平。结果：1不同乳腺癌细胞的侵袭能力比较用Image J图像分析系统读取条带面积、宽度和灰度值进行结果分析，MMP9蛋白在乳腺癌MDA-MB-436（1.44±0.15）细胞中的活性明显高于MDA-MB-453（0.31±0.04）和SKBR-3（0.37±0.08）细胞，差异均有显著性（P＜0.01）。MMP2蛋白在乳腺癌MDA-MB-436（1.65±0.37）细胞中的活性明显高于MDA-MB-453（0.40±0.11）和SKBR-3（0.38±0.09）细胞，差异均有显著性（P＜0.01）。2不同乳腺癌细胞的迁移能力比较对不同乳腺癌细胞迁移距离的分析结果显示，乳腺癌MDA-MB-453细胞在划痕6小时（1.82±0.79%）和12小时（3.37±1.36%）与SKBR-3细胞6小时（2.41±0.92%）和12小时（4.52±0.89%）的迁移率比较均无明显差异，乳腺癌MDA-MB-436细胞在划痕6小时（18.71±4.06%）和12小时（36.80±3.42%）的迁移率均明显高于处于相应时间点的MDA-MB-453、SKBR-3细胞，差异均有显著性（P＜0.01）。3不同乳腺癌细胞Caveolin-1、EGFR、HER-2的蛋白表达经Image J图像分析系统对蛋白条带进行灰度扫描分析，结果发现，Caveolin-1蛋白在乳腺癌MDA-MB-436(2.40±0.39)细胞中的表达明显高于MDA-MB-453（0.03±0.01）和SKBR-3（0.03±0.00)细胞，差异均有显著性（P＜0.01）。HER-2蛋白在乳腺癌MDA-MB-453（1.05±0.13）、SKBR-3（2.12±0.32）细胞中的表达均明显高于MDA-MB-436（0.03±0.02）细胞，差异均有显著性（P＜0.01）。EGFR蛋白在乳腺癌MDA-MB-436（0.75±0.07）、 SKBR-3（0.97±0.10）细胞中的表达均明显高于MDA-MB-453（0.01±0.00）细胞，差异均有显著性（P＜0.05）。4Caveolin-1和EGFR在乳腺癌细胞内的定位激光共聚焦显微镜观察，在乳腺癌MDA-MB-436细胞中，Caveolin-1和EGFR蛋白共存于细胞膜上。5沉默或过表达Caveolin-1对乳腺癌细胞EGFR、HER-2和ERK磷酸化水平的影响5.1Caveolin-1过表达对乳腺癌细胞EGFR、HER-2及ERK磷酸化水平的影响用Image J图像分析系统对蛋白条带进行灰度扫描分析，结果显示，Caveolin-1pcDNA质粒转染乳腺癌MDA-MB-453细胞，20nM EGF持续刺激细胞0min、5min、10min、30min后，Caveolin-1pcDNA转染组Caveolin-1蛋白的表达（1.11±0.08、1.14±0.03、1.14±0.02、1.16±0.04）均明显高于相应时间点pcDNA3.1转染组（0.01±0.00、0.01±0.00、0.01±0.00、0.01±0.00），差异均有显著性（P＜0.01）。20nM EGF持续刺激细胞5min、10min、30min后，Caveolin-1pcDNA转染组HER-2（0.48±0.05、0.57±0.09、0.40±0.02）、ERK（0.65±0.04、0.84±0.03、0.07±0.02）蛋白磷酸化水平均明显低于相应时间点pcDNA3.1转染组HER-2（0.76±0.03、0.87±0.06、0.65±0.12）、ERK（1.11±0.02、1.32±0.05、0.16±0.02）蛋白磷酸化水平，差异均有显著性（P＜0.05）。Caveolin-1pcDNA质粒转染乳腺癌SKBR-3细胞，20nM EGF持续刺激细胞0min、5min、10min、30min后，Caveolin-1pcDNA转染组Caveolin-1蛋白的表达（1.26±0.12、1.26±0.05、1.32±0.04、1.32±0.02）均明显高于相应时间点pcDNA3.1转染组（0.02±0.02、0.02±0.02、0.02±0.02、0.02±0.02），差异均有显著性（P＜0.01）。20nM EGF持续刺激细胞5min、10min、30min后，Caveolin-1pcDNA转染组HER-2（0.32±0.02、0.43±0.03、0.19±0.03）、EGFR（0.24±0.02、0.37±0.03、0.13±0.02）、ERK（0.06±0.02、0.40±0.16、0.36±0.04）蛋白磷酸化水平均明显低于相应时间点pcDNA3.1转染组HER-2（0.45±0.02、0.55±0.03、0.28±0.02）、EGFR（0.55±0.03、0.68±0.03、0.25±0.02）、ERK（0.40±0.02、0.93±0.09、0.45±0.03）蛋白磷酸化水平，差异均有显著性（P＜0.05）。5.2沉默Caveolin-1表达对乳腺癌细胞EGFR、ERK磷酸化水平的影响用Image J图像分析系统对蛋白条带进行灰度扫描分析，结果显示，Caveolin-1siRNA质粒转染乳腺癌MDA-MB-436细胞，20nM EGF持续刺激细胞0min、5min、10min、30min后，Caveolin-1siRNA转染组Caveolin-1蛋白的表达（0.77±0.07、0.78±0.03、0.81±0.1、0.83±0.04）均明显低于相应时间点Shut1转染组（1.28±0.08、1.30±0.07、1.31±0.04、1.33±0.06），差异均有显著性（P＜0.01）。20nM EGF持续刺激细胞5min、10min、30min后，Caveolin-1siRNA转染组EGFR（1.15±0.02、1.27±0.02、0.72±0.03）、ERK（0.71±0.02、0.85±0.02、0.61±0.03）蛋白磷酸化水平均明显高于相应时间点Shut1转染组EGFR（0.53±0.02、0.66±0.03、0.20±0.02）、ERK（0.41±0.02、0.50±0.03、0.31±0.01）蛋白磷酸化水平，差异均有显著性（P＜0.01）。6Caveolin-1对乳腺癌细胞增殖的影响在100nM浓度EGF刺激下，Caveolin-1pcDNA转染组MDA-MB-453（0.87±0.16）、SKBR-3（0.99±0.18）细胞的增殖水平均低于pcDNA3.1转染组MDA-MB-453（1.31±0.08）、SKBR-3（1.29±0.05）细胞，差异均有显著性（P＜0.05）；Caveolin-1siRNA转染组MDA-MB-436（0.84±0.03）细胞的增殖水平明显高于阴性对照Shut1转染组（0.68±0.03），差异有显著性（P＜0.01）。结论：1在乳腺癌细胞中，EGFR和HER-2蛋白表达水平不是决定配体诱导其活化、侵袭和迁移的唯一因素。2Caveolin-1通过影响乳腺癌细胞EGFR、HER-2蛋白磷酸化水平，调节二者所介导的Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路及其下游信号分子的激活，进而影响乳腺癌细胞的增殖。