飞蝗(Locusta migratoria)是一种重要的迁飞性农业害虫,依赖其功能强大的前后翅而具有长距离、大规模迁徙能力,大密度的群居型飞蝗容易导致蝗灾的发生而引起严重的粮食危机,是历代农业生产中危害极大的一种。翅的产生使昆虫具有迁飞能力,在其躲避敌害和繁衍觅食等方面发挥了重要的作用,使其更加适应复杂多变的生活环境。翅的生长发育受多个基因及信号通路的调节,同时细胞之间的连接作用以及细胞与胞外基质之间的相互作用在昆虫翅的生长发育过程中发挥着关键作用。整合素是一种存在于细胞表面的细胞粘连分子,由α和β亚基组成,在昆虫免疫反应、细胞骨架构成和生长发育中具有重要作用。然而整合素在昆虫尤其是渐变态迁飞害虫翅发育中的作用机制尚不清楚。因此,本文以渐变态迁飞害虫-飞蝗为研究对象,利用目前在转录组数据库中发现的一个整合素β亚基,探究整合素β亚基在飞蝗翅发育中的作用机制,为迁飞害虫的生物防治提供新的靶标。本研究利用飞蝗中编码一种整合素β亚基蛋白的LmIntegrinβ-PS基因为研究靶标,对其进行分子特性、表达分析,利用RNAi技术探讨该基因在飞蝗翅发育过程中的生物学功能,研究结果如下:1.LmIntegrinβ-PS序列分析和表达分析根据飞蝗转录组和基因组数据库获得LmIntegrinβ的cDNA序列,这与先前已发现的未被鉴定功能的编码整合素蛋白的开放阅读框序列(KJ535130.1)一致,对其基因结构分析发现其含有12个外显子,共编码864个氨基酸,包含一个信号肽(SP)、von Willebrand factor(vWF)type A结构、表皮生长因子(EGF)、一个beta尾部(tail domain)、一个较短的跨膜域(TM)和胞质域尾部(beta cytoplasmic);Integrinβ-PS在不同物种间保守性较高,多重序列比对发现其都含有金属离子黏附剂区(MIDAS)、半胱氨酸重复区(cys-repeats)、一个跨膜域(TM)和胞质尾部的结合位点(NxxY/F)等。根据其编码的氨基酸序列与其它昆虫中的同源蛋白序列相似性将其命名为LmIntegrinβ-PS,聚类分析结果显示LmIntegrinβ-PS与蜚蠊目聚为一支;采用RT-qPCR技术检测LmIntegrinβ-PS在五龄若虫的时空表达特性,结果显示其在所有组织中均有表达,但在翅芽的表达较高且在五龄中期表达达到峰值。2.基于RNA interference的生物学功能研究RNA interference(RNAi)技术是简便高效的基因沉默技术,利用飞蝗对RNAi敏感的特性,分别在四龄和五龄第1天若虫注射dsRNA对LmIntegrinβ-PS进行干扰。结果显示,与对照组相比,注射dsLmIntegrinβ-PS的四龄若虫可以成功蜕皮到五龄,但约65%的若虫翅芽出现形态异常表型,其中40%的若虫出现泡状翅以及25%的若虫翅芽出现无法正常闭合的现象。同样,注射dsLmIntegrinβ-PS的五龄若虫在蜕皮至成虫过程中,约有58%的若虫在翅基部挤满水泡无法蜕皮导致死亡,而约30%若虫能够成功蜕皮,但成虫前后翅充满水泡,形成泡状翅。结果表明,LmIntegrinβ-PS在飞蝗若虫翅芽和成虫翅的发育中均具有重要作用。组织定位结果显示LmIntegrinβ-PS主要定位在翅表皮细胞底部的基底膜处,推测其可能介导细胞和基底膜处的连接作用。3.LmIntegrinβ-PS对飞蝗翅表皮结构的影响为进一步探究LmIntegrinβ-PS在飞蝗翅生长发育过程中的作用机制。首先根据RNAi结果对翅芽组织进行H&E染色,结果发现,与对照组相比,注射dsLmIntegrinβ-PS的处理组中飞蝗翅表皮细胞层明显失去与基底膜处的连接,而导致翅背腹两层细胞失去连接而形成一个巨大的空腔。随后通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察翅表面和表皮超微结构的变化,SEM结果显示,与对照组中翅表面的正常结构相比,处理组的翅表面严重皱缩,刚毛减少变弯,端部变扁弯曲;TEM结果表明:LmIntegrinβ-PS沉默后,细胞连接处发生降解,细胞排列紊乱,翅结构破坏明显。RT-qPCR技术检测发现处理组中细胞连接相关基因的表达相比于对照组显著降低,推测LmIntegrinβ-PS可能通过调控其它细胞连接相关基因的表达保证正常的细胞连接和细胞骨架的稳态参与飞蝗翅的生长发育。综上所述,本文以LmIntegrinβ-PS为靶标,研究发现其可能参与飞蝗翅表皮细胞层与基底膜的连接进而参与若虫翅芽和成虫翅的发育,研究结果将为整合素在昆虫翅发育中的作用机制研究提供理论依据,同时也为以迁飞害虫翅为靶标的害虫防治提供基础。