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疯草（locoweed）主要包括豆科黄芪属（Astragalus）、棘豆属（Oxytropis）和苦马豆属（Sphaerophysa）有毒植物,用来形容动物采食这类植物后出现的“发疯”症状。疯草的主要毒性成分苦马豆素（swainsonine,SW）是一种吲哚里西啶类生物碱,最先从灰苦马豆中分离得到,由生活在疯草类有毒植物中的内生真菌产生。目前,疯草在世界各地均有发现,随着全球气候变化和超载过牧等因素干扰,疯草已成为威胁天然草地牲畜生产的主要有毒植物。据统计,仅在美国和中国,每年因疯草中毒造成的经济损失高达2千万至2亿美元,严重阻碍草地畜牧业的可持续发展。由此可见,探究苦马豆素毒性作用的分子机制,有助于深入揭示动物疯草中毒致病机理,从而为寻找新的诊断靶点和筛选防治药剂提供重要理论依据。O-GlcNAc修饰是一种特殊的糖基化修饰,可通过调节自噬过程影响机体的生理及病理发展,而自噬又是机体维持细胞和组织稳态所必需的降解途径。前期研究发现,疯草中毒动物临床表现为共济失调、消瘦、流产,甚至死亡,病理变化可观察到脑、肝脏、肾脏及睾丸等多种器官组织发生广泛的空泡样病变。其毒性作用机制是苦马豆素通过抑制机体α-甘露糖苷酶活性,导致细胞内糖基化修饰发生障碍,致使细胞内低聚糖、糖蛋白、糖脂等糖缀合物蓄积,最终造成动物实质器官受损,尤其是中枢神经系统和肝肾等脏器最为严重。因此,为了进一步揭示苦马豆素引起肾毒性损伤的具体分子机制,本试验以大鼠原代肾小管上皮细胞为研究模型,通过体外添加苦马豆素,探究细胞程序性死亡和O-GlcNAc修饰在苦马豆素致大鼠原代肾小管上皮细胞损伤中的作用关系,针对性阐明O-GlcNAc修饰介导的自噬在苦马豆素致大鼠原代肾小管上皮细胞损伤中的分子机制。本研究取得以下结果:1.苦马豆素诱导大鼠原代肾小管上皮细胞发生凋亡、自噬及类凋亡。通过胶原酶消化法分离、鉴定得到大鼠原代肾小管上皮细胞,苦马豆素处理后,细胞染色质出现固缩、不规则形态;Western blot结果显示cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白的表达呈时间-剂量依赖性方式增加;流式细胞术结果表明,苦马豆素处理显著增加了细胞凋亡率。同时,苦马豆素以时间-剂量依赖性方式显著升高LC3-II等自噬相关蛋白的表达水平;透射电镜观察发现,苦马豆素处理增加胞质中自噬体积累。但使用自噬激动剂Rapa,自噬后期抑制剂Baf A1和凋亡抑制剂z-VAD-fmk预处理,不能显著改善苦马豆素诱导的胞质空泡化。ER-Tracker Red荧光探针及透射电镜观察到空泡出现在内质网周围,且随着苦马豆素剂量的增加,内质网应激相关蛋白Bip、Chop等蛋白的表达均增加;而且,泛素化蛋白在苦马豆素处理的细胞中逐渐积累,细胞类凋亡抑制因子Alix表达下调;内质网应激抑制剂4-PBA预处理可以显著抑制苦马豆素诱导的胞质空泡化。以上结果说明,苦马豆素可以诱导大鼠原代肾小管上皮细胞发生凋亡、自噬及类凋亡,且苦马豆素引起的胞质空泡化与内质网应激依赖性类凋亡有关。2.苦马豆素处理大鼠原代肾小管上皮细胞的蛋白组学分析。经蛋白组学分析,鉴定出7014种蛋白质,其中5697种蛋白质被定量;以倍数变化＞1.2或＜0.67和p＜0.05的阈值过滤后比较蛋白质表达水平,最终发现有95个蛋白质表达上调和64个蛋白质表达下调;对差异性蛋白进行GO功能富集分析,在影响较为显著的20个细胞组分分类中,其中有4个与自噬-溶酶体途径有关;较为显著的20个分子功能分类中,5个途径与糖基化修饰有关。通过western blot对有关差异蛋白进行验证发现,p62表达水平升高,m-CTSD表达降低,说明苦马豆素损害溶酶体功能;而且抑制自噬降解进一步促进苦马豆素诱导的凋亡及内质网应激。以上结果说明,苦马豆素中毒机制与自噬-溶酶体途径降解障碍有关,而且涉及糖基化修饰过程。3.苦马豆素改变大鼠原代肾小管上皮细胞中的O-GlcNAc糖基化修饰。利用western blot检测发现,苦马豆素通过改变HBP途径关键酶GFAT1的表达,影响大鼠原代肾小管上皮细胞总蛋白的O-GlcNAc修饰水平;使用O-G1c NAc糖基化修饰激动剂和抑制剂发现,增加O-G1c NAc糖基化修饰水平可以抑制凋亡,促进自噬,减弱内质网应激;而降低O-G1c NAc糖基化修饰水平可以促进凋亡,抑制自噬,增加内质网应激。通过IP试验发现,溶酶体组织蛋白酶CTSD可以被O-GlcNAc糖基化修饰,而且高剂量苦马豆素使CTSD蛋白的O-GlcNAc修饰水平降低;质谱分析显示,CTSD蛋白的255位S和260位T发生O-GlcNAc修饰,将255位S和260位T突变后,m-CTSD表达减少。以上结果说明,苦马豆素可通过降低CTSD的O-G1c NAc修饰抑制自噬降解,从而增强苦马豆素引起的凋亡及内质网应激。综上所述,苦马豆素可以诱导大鼠原代肾小管上皮细胞发生凋亡、自噬及类凋亡,且苦马豆素导致的胞质空泡化与内质网应激依赖性类凋亡有关;虽然苦马豆素可以激活自噬,但也损害溶酶体功能,从而抑制自噬降解;具体的分子机制是由于苦马豆素可以改变CTSD的O-GlcNAc修饰,进而影响自噬-溶酶体途径,最终导致错误蛋白积累,引起细胞死亡。本研究为深入揭示疯草中毒致病机理提供了新的分子生物学基础,也为疯草中毒病防治提供了新靶标。