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细菌素是人类研究较为深入的微生物防御物质,具有种类多样,来源丰富,无毒高效等特点。随着化学防腐剂的泛滥和抗生素耐药病原菌的出现,安全高效的细菌素在食品防腐、医疗保健以及动物饲料行业具有巨大的潜力。到目前为止,只有nisin一种细菌素被商业化应用于食品防腐行业,且存在抑菌谱窄,只能抑制部分革兰氏阳性菌的缺陷。因此开发其他广域抑菌的细菌素就非常有必要。本文的实验对象是IIb类细菌素PlnJ/K,其中多肽PlnJ含有25个氨基酸,多肽PlnK含有32个氨基酸。当这两个不同的多肽协同作用时,抑菌活性将明显增强。本实验室筛选得到一株具有广谱抗菌性的植物乳杆菌ZJ316,在其全基因组序列中的植物乳杆菌素基因簇中发现细菌素基因plnJ和plnK,并在大肠杆菌中成功地表达这两个基因。通过一系列的分离纯化得到目标蛋白,并对目标蛋白进行了初步的抗菌活性研究。具体内容如下：1)设计plnJ和plnK基因合成序列,在两个基因的5’端添加一个肠激酶酶切位点,目的是为了表达目标蛋白后,用肠激酶酶切,能得到未经任何修饰的成熟肽PlnJ和PlnK。2)设计引物,对合成基因plnJ和plnK进行PCR扩增,将扩增产物与表达载体pET-32a进行Kpn I和Xho I双酶切,构建pET-32a-plnJ和pET-32a-plnK重组表达质粒。将重组质粒转化至表达菌株BL21(DE3)中,通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE验证重组蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK被顺利诱导。3)为减少包涵体的产生,将重组表达菌株BL21-pET-32a-plnJ和BL21-pET-32a-plnK在1mM IPTG,16℃,160rpm的条件下过夜诱导表达,菌体超声破碎后离心收集上清。4)超声破碎上清为含有组氨酸标签的融合蛋白pET-32a-PlnJ和pET-32a-PlnK的粗提液,通过镍柱吸附融合蛋白,利用咪唑与组氨酸标签竞争镍柱的结合位点,洗脱得到的融合蛋白即为纯度较高的重组蛋白,脱盐浓缩后,利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白的浓度,分别为880μg/mL和720μg/mL。肠激酶酶切得到两种蛋白PlnJ和PlnK,分子量的大小分别为2.9kDa和3.5kDa,用10kDa超滤离心管离心收集分子量小的蛋白,即滤液中含有目标蛋白PlnJ和PlnK。5)对分离得到的目标蛋白PlnJ和PnK进行抑菌活性研究,指示菌为大肠杆菌和单增李斯特菌,采用牛津杯双层平板抑菌法和96孔板抑菌法。在双层平板抑菌法中,单独的PlnJ或PlnK没有非常明显的抑菌作用,而PlnJ和PlnK等量混合液PlnJK呈现出明显的抑菌圈；在96孔板法中,不同浓度的PlnJ、PlnK以及PlnJK对指示菌显示出不同的抗菌活性,其中PlnJK的抗菌活性远远大于单独地PlnJ或PlnK。