论文部分内容阅读
由柑橘白地霉（Geotrichum citri-aurantii）侵染柑橘引起的酸腐病是仅次于柑橘果实青、绿霉病的一种典型柑橘采后病害,对全球所有柑橘品种均具有不同程度的危害,造成柑橘产业的严重损失及环境的潜在污染。目前国内对酸腐病控制最有效的是双胍盐类杀菌剂百可得（Bellkute,iminoctadine tris）。但是随着化学杀菌剂的长期使用,国内柑橘产区的酸腐病病原菌对百可得均出现了不同程度的抗药性。因此,亟待开发更加安全、有效的绿色保鲜剂或替代产品。生物防治方法逐渐受到关注,利用拮抗酵母菌控制果实采后病害更是一种有效的生物防治方式。应用于果实病害控制的拮抗酵母多数分离自果实体系,能快速适应果实表面的微生态,具有营养需求低、能长期适应复杂多变的环境、对病原菌抑菌谱较为广泛、不产生致敏孢子和真菌毒素等优点而显示出较大的应用潜力。桔梅奇酵母M.citriensis是由我们实验室分离自柑橘叶际的新种酵母,对柑橘果实采后青绿霉病有极好的生物防治效果。而梅奇属酵母对柑橘采后酸腐病的控制效果尚待研究。本研究基于生物防治的角度,探究桔梅奇酵母Metschnikowia.citriensis对柑橘采后酸腐病的控制效果,并系统的研究其拮抗作用模式,提出可能的重要作用机制,并深入探究了其对生防效力的贡献量。在此基础进一步靶向性的增强了M.citriensis的生防效力,并对其可能涉及的机理进行探究。主要研究结果如下:（1）M.citriensis能显著控制柑橘采后酸腐病,与常温贮藏条件对比,低温贮藏下M.citriensis对酸腐病的防治效果更佳。M.citriensis能在果实伤口处快速生长,具有生物膜形成能力,M.citriensis发酵液的非细胞组分以及所产生的挥发性有机化合物（VOCs）对G.citri-aurantii生长没有显著抑制效应;M.citriensis对G.citri-aurantii菌丝有微弱附着作用,但没有寄生作用。M.citriensis对柑橘果实具有一定的诱导抗病性。外源Fe Cl3添加影响M.citriensis对G.citri-aurantii生长的抑制作用,以及对酸腐病的控制效果,推测M.citriensis产普切明酸（PA）对铁离子的竞争或消耗是其控制柑橘果实采后酸腐病的重要作用机制之一。（2）通过全基因组测序获得了M.citriensis FL01精细基因组信息。M.citriensis FL01基因组大小约为25.74 Mb,组装到12个Contigs上,基因组GC含量为49.16%。散在重复序列占据0.76%,串联重复序列占据1.27%,含有313个t RNA,185个r RNA,52个sn RNA。共预测到5189个编码蛋白基因,其中3401个基因得到GO分类注释,4137个基因得到KEGG注释,1845个基因与KOG数据库匹配并得到功能分类。M.citriensis FL01具有丰富的胞内外信号转导、代谢相关基因,暗示酵母细胞代谢旺盛、环境适应力强。共线性分析显示,M.citriensis FL01与M.pulcherrima APC 1.2的亲缘关系更近。通过与M.pulcherrima的PULs基因进行全基因组的BLAST比对,找到了M.citriensis FL01中四个PUL基因:PUL1（1377bp）、PUL2（1433 bp）、PUL3（960 bp）和PUL4（1638 bp）,位于Contig4上,成簇分布。其中PUL1和PUL3正向表达,PUL2和PUL4反向表达,PULs基因的分布与M.pulcherrima APC 1.2的一致。（3）通过CRISPR/Cas9技术对M.citriensis生物合成PA的关键基因PUL2进行敲除,获得了不产普切明色素的稳定突变株。失去产普切明色素的突变ΔM.citriensis与野生型酵母相比,其生长能力和孢子形态没有显著变化,但是均失去了产PA的能力或者产PA非常微量而无法检出。突变ΔM.citriensis在离体平板实验中均失去了对G.citri-aurantii生长的抑制作用,在果实实验中,突变菌株对酸腐病的控制效果显著低于野生型酵母,相比于野生型酵母的生防控制效率下降80%左右,且各突变菌株之间的生防效果无显著差异,从而直接证明了产PA引起的铁离子的消耗是M.citriensis控制柑橘采后酸腐病的重要作用机制。（4）基于提高PA产量从而提高M.citriensis生防效力,从生理调控增效的角度筛选能提高M.citriensis PA生成量的氨基酸,所测试的20种氨基酸中除甲硫氨酸（Met）外,外源氨基酸处理均能显著诱导M.citriensis普切明的生成。丝氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）和精氨酸（Arg）能诱导M.citriensis产生相对于其他氨基酸更宽的普切明色素带,且Arg的诱导效应最明显。（5）通过不同浓度的Arg处理发现,Arg对M.citriensis生长、PA生成量及PULs基因的表达量的诱导具有浓度效应。低浓度(1 mmol·L-1)Arg对M.citriensis生长没有显著影响,而5 mmol·L-1和10 mmol·L-1Arg则能促进M.citriensis生长。PA作为M.citriensis的次生代谢产物,Arg处理能显著诱导M.citriensis在培养的对数中后期提高PA的生成量。不同浓度的Arg在不同培养时间点对PA合成调控的四个基因PUL1、PUL2、PUL3和PUL4表达量的影响不同,在诱导培养的24h～72 h内,Arg处理能显著诱导这4个基因的上调表达,而PUL4在M.citriensis生长的12 h内被抑制了表达。总体上,相对于1 mmol·L-1的Arg,5 mmol·L-1和10 mmol·L-1的Arg更能显著的诱导M.citriensis PULs基因的表达,从而诱导M.citriensis合成并分泌更多的PA。（6）Arg处理提高了M.citriensis在果实伤口处的定殖能力,预示Arg能提高拮抗酵母的氧化胁迫耐受性。进一步通过H2O2诱导氧化胁迫,发现Arg预处理提高了M.citriensis胞内抗氧化酶:CAT（过氧化氢酶）、SOD（超氧化物歧化酶）和GPX（谷胱甘肽过氧化物酶）活性以及抗逆性物质海藻糖含量,降低胞内ROS（活性氧）水平,进而抑制过量ROS引起的细胞凋亡、质膜损伤和胞内蛋白氧化,提高了M.citriensis细胞氧化胁迫耐受性。（7）通过比对提高PA生成量的Arg处理,以及失去产PA能力的突变体酵母ΔM.c7的生防效力,发现Arg预处理能显著增强M.citriensis对柑橘酸腐病的防控效力,且5 mmol·L-1Arg预处理的M.citriensis的生防效力相对最优。主要作用机制可能包含:（1）Arg预处理诱导了M.citriensis PA生成量的增加;（2）Arg预处理提高了M.citriensis在果实伤口处的定殖能力;（3）Arg预处理增强了M.citriensis生物膜生成能力;（4）Arg预处理提了高M.citriensis在柑橘伤口处的氧化胁迫耐受性。而失去产PA能力的突变体酵母ΔM.c7在果实伤口处的定殖能力、生物膜形成能力、氧化胁迫耐受性、抗氧化能力及生防效力显著下降。进一步说明了M.citriensis的PA生成能力与其生防效力直接相关,同时又会影响M.citriensis胞内的抗氧化反应。此外PA可能作为一种群体感应分子介导M.citriensis生物膜生成。