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肠道病毒71型(enterovirus71, EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属(Enterovirus)成员,是引起手足口病(hand-foot-and-mouth disease, HFMD)的主要病原体之一。此外,EV71还可侵犯呼吸系统、中枢神经系统及心血管系统而引起脑炎、心肌炎、肺水肿和弛缓性麻痹等症状。近年来亚洲地区的EV71流行呈上升趋势。目的1.扩增EV71毒株基因组全序列,筛选神经毒力位点；2.构建VP1蛋白的表达载体及突变体,从VP1基因上寻找可疑毒力位点,比较突变前后其引起的细胞损伤的变化情况。方法1.设计9对首尾相接的引物扩增3株SC-EV71(SDLY96、SDLY107、 SDLY153)基因组全序列,将此3株毒株的基因组全序列与本实验室扩增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株临床类型明确的EV71毒株的基因组全序列进行序列比对。2.设计引物扩增23株EV71毒株的VP1基因并测序,以BioEdit7.09和Mega4.0软件对测序结果进行分析。3.设计引物扩增SDLY11及SDLY107株的VP1基因,构建表达载体pcDNA3.1(+)/11VP1及pcDNA3.1(+)/107VP1。将3株SC-EV71(SDLY96、 SDLY107、SDLY153)和3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)的VP1序列进行比对,筛选出3个可疑氨基酸位点P98、P145及P289,设计突变引物,以pcDNA3.1(+)/107VP1为模板,同源重组PCR法构建3个单个氨基酸突变的表达载体107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。上述5个表达载体转染RD细胞后,Giemsa染色、间接免疫荧光、(?)(?)estern blot进行细胞病变程度的定性检测,乳酸脱氢酶法(LDH)细胞毒性检测法进行细胞病变程度的定量检测。4.从已测知全序列的6株毒株中,选取分离自死亡病例的SDLY107株,采用多种方法构建全长cDNA质粒,构建失败后合成全长cDNA质粒pCDNA3.1(+)/SDLY107,(?)各全长cDNA质粒酶切线性化,进行体外转录制备RNA转录本,RNA转录本转染RD细胞。结果1.扩增出SDLY96、SDLY107及SDLY153株的基因组全序列,将此3株毒株的基因组全序列与本实验室扩增的3株MC-EV71(SDLY1、SDLY11、SDLY48)及GenBank中的25株临床类型明确的EV71毒株的基因组全序列进行序列比对,共筛选出3个有意义的位点,这三个位点分别为ValP814/IleP814、Valp1148/IleP1148和Ala P1728/CysP1728/Va1P17282.扩增出23株毒株的VP1基因。将此23株毒株的VPl序列与各基因型代表株的VP1序列进行比对,发现此23株EV71分离株与A、B基因型同源性较低；与C4亚型的C4a群代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别为92.8%-93.5%和98.3%～99.3%,明显高于其他亚型代表株的同源性。3.构建了表达载体pcDNA3.1(+)/11P1、pcDNA3.1(+)/107VP1及突变体107VP1/K98E、107VP1/E145G、107VP1/A289T。Giemsa染色显示转染了5种表达载体的细胞均有不同程度的细胞损伤；间接免疫荧光显示转染了5种表达载体的细胞均有亮绿色荧光信号产生；Western blot(?)显示转染了5种表达载体的细胞均可表达34KD的VP1蛋白,LDH法细胞毒性检测结果显示pcDNA3.1(+)/107VP1、107VP1/k98E、107VP1/A289T引起的细胞损伤程度最大且基本相同,pcDNA3.1(+)/11VP1引起的细胞损伤程度最小,107VP1/E145G引起的细胞损伤程度介于中间。4.由于构建SDLY107全长cDNA质粒失败,将其序列送公司合成全长cDNA质粒pCDNA3.1(+)-SDLY107,将其酶切线性化,制备RNA转录本转染RD细胞。目前尚未观察到细胞病变,细胞培养物提取RNA后PCR鉴定也未获得相应片段。结论1.全基因组序列比对筛选出3个可能与神经毒力相关或与基因型相关的位点,分别为位于VPl的ValP814/IleP814、位于3A的Valp1148/IleP1148和位于3C的Ala P1728/Cys P1728/Val P1728。2.23株毒株的VPl序列与各基因型代表株的VP1序列进行比对,发现此23株EV71分离株属C4亚型的C4a群。3.VP1蛋白的第145位氨基酸(基因组全序列第710位氨基酸)是可疑毒力位点,E→G突变后其引起的细胞损伤程度降低。