目的和意义增生性瘢痕或瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维化过程,可限制活动,影响皮肤的美观和功能,是皮肤组织烧伤、创伤修复后,由于全身和局部因素的影响,导致细胞外基质(ECM)过度分泌沉积、大量纤维组织增生、胶原降解减少、血管大量生成,包括成纤维细胞在内的组织修复细胞异常增殖分化而形成的。在纤维化的起始阶段,各种始动因素促使多种细胞因子的释放。细胞因子网络在介导炎症及其后的纤维化过程中所起的作用日益受到重视。有研究表明,在纤维化形成过程中存在1型辅助性T细胞(Th1)和2型辅助性T细胞(Th2)细胞因子间的失衡,即Th1/Th2失衡,从而促进了成纤维细胞激活、增生,细胞外基质沉积。Th1型细胞因子包括IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-18和肿瘤坏死因子-β(TNF-β),Th2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、IL-13和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)。Th1型和Th2型细胞因子应答在纤维化方面的相反效应(即Th1型细胞因子的抗纤维化效应和Th2型细胞因子的促纤维化效应)已被近来的基因芯片技术所证实。白细胞介素13(IL-13)是一种多效能的免疫调节性细胞因子,主要由激活的辅助T淋巴细胞(Th2)产生,是许多由II类细胞因子决定的病理过程的关键诱导物。它能调节炎症、黏液产生、组织重建和纤维化,它在皮肤纤维化、肺纤维化、肝纤维化等多种纤维化疾病的发生机制中起重要作用,也是多种纤维化疾病的重要治疗靶点。为研究IL-13在瘢痕形成过程中的潜在作用,本研究探讨IL-13对瘢痕成纤维细胞的胶原合成作用及信号转导途径,观察IL-13是否促进瘢痕成纤维细胞胶原基因的转录和胶原蛋白的合成,这一过程是否通过IL-13结合瘢痕成纤维细胞膜上的IL-13受体,从而激活JAK/STAT信号转导通路,将胞内信号转导和转录激活因子STAT6蛋白磷酸化,后转入核内与胶原靶基因结合,上调胶原基因的转录,促进胶原蛋白的合成。另外观察酪氨酸酶抑制剂来氟米特A77 1726和抗纤维化药物干扰素-γ是否阻断IL-13的促瘢痕成纤维细胞的胶原合成作用,从而为IL-13纤维化机制的研究和瘢痕发生机制的研究增添新内容,同时为新方法用于临床瘢痕治疗奠定理论基础和提供实验依据。研究内容和方法1.IL-13对成纤维细胞的胶原合成作用的影响:体外培养成纤维细胞,绘制细胞生长曲线观察细胞生长状态。细胞分为实验组和对照组,实验组加入IL-13(100μg/L),对照组不加细胞因子,HE染色观察细胞形态,胶原纤维的特殊染色观察胶原纤维的形成,MTT法观察不同浓度的IL-13对成纤维细胞增殖作用的影响。IL-13细胞分为实验组和对照组,实验组加入IL-13(100μg/L),作用24、48、72小时后,绘制细胞生长曲线观察细胞生长状态,HE染色观察细胞形态,胶原纤维的特殊染色观察胶原纤维的形成,MTT法观察IL-13对成纤维细胞增殖作用的影响,羟脯氨酸检测IL-13对成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响,RT-PCR观察IL-13对成纤维细胞I型胶原α1基因(Type I procollagen alpha 1,COL1A1)mRNA水平表达的影响,Western-Blotting观察IL-13对成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的影响。2.IL-13对成纤维细胞作用的信号转导通路的研究:RT-PCR检测成纤维细胞IL-13受体α1的表达,Western-Blotting观察IL-13作用成纤维细胞1、2、4、8小时后转录因子STAT6磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白的表达。3.酪氨酸酶抑制剂来氟米特A77 1726阻断IL-13对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用:MTT法观察不同浓度的A77 1726对成纤维细胞的增殖作用的影响。成纤维细胞分为实验组和实验对照组,实验对照组加入IL-13(100μg/L),实验组加入来氟米特A77 1726(50μM)和IL-13(100μg/L),作用24、48、72小时后,MTT法观察来氟米特对成纤维细胞的增殖作用的影响,羟脯氨酸检测来氟米特A77 1726对IL-13促进成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响,RT-PCR观察来氟米特A77 1726对IL-13促进成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA水平表达的影响, Western-Blotting观察来氟米特A77 1726对IL-13促进成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的影响。4.干扰素-γ抑制IL-13对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用:MTT法观察不同浓度的干扰素-γ对成纤维细胞的增殖作用的影响。成纤维细胞分为实验组和空白对照组,实验组加入干扰素-γ(4×105U/L)和IL-13(100μg/L),作用24、48、72小时后,羟脯氨酸检测干扰素-γ是否抑制IL-13促进成纤维细胞分泌胶原蛋白,RT-PCR观察干扰素-γ是否抑制IL-13促进成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA水平的表达, Western-Blotting观察干扰素-γ是否抑制IL-13促进成纤维细胞分泌I型胶原蛋白。结果1.IL-13促进成纤维细胞的胶原合成作用:HE染色观察到实验组细胞增长旺盛,有明显的交叉重叠现象,胞浆丰富,但大体形态与对照组细胞无明显差别;胶原纤维特殊染色观察到实验组胶原纤维合成增加;MTT法观察到IL-13呈剂量依赖方式促进瘢痕成纤维细胞增殖;羟脯氨酸检测实验组细胞培养上清液分泌总胶原蛋白含量在IL-13作用48h、72h后显著高于对照组(P<0.05);RT-PCR检测到成纤维细胞表达I型胶原α1基因,且IL-13作用48h、72h后,表达显著增强(P<0.05);Western Blotting检测到成纤维细胞表达I型胶原蛋白,且IL-13作用48h、72h后,表达显著增强(P<0.05)。2.IL-13介导成纤维细胞STAT6磷酸化:RT-PCR检测到成纤维细胞表达IL-13受体α1,Western-Blotting观察IL-13作用成纤维细胞1、2、4、8小时后均有非磷酸化STAT6蛋白的表达,IL-13作用2h后磷酸化STAT6蛋白表达最强(P<0.05),4h后衰减。3.酪氨酸酶抑制剂来氟米特A77 1726阻断IL-13对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用:MTT法观察到来氟米特A77 172650μM的浓度可显著抑制成纤维细胞的增殖(P<0.05),羟脯氨酸检测实验组48h组和72h组成纤维细胞分泌胶原蛋白的含量显著低于实验对照组(P<0.05),RT-PCR观察到实验组48h组和72h组成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA表达水平显著低于实验对照组(P<0.05),Western-Blotting观察到实验组48h组和72h组成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的水平显著低于空白对照组(P<0.05)。4.干扰素-γ抑制IL-13对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用:MTT法观察到干扰素-γ来氟米特50μM的浓度可显著抑制成纤维细胞的增殖(P<0.05),羟脯氨酸检测各时间段实验组48h组和72h组成纤维细胞分泌胶原蛋白的含量显著低于空白对照组(P<0.05),RT-PCR观察到各时间段实验组48h组和72h组成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA表达水平显著低于空白对照组(P<0.05),Western-Blotting观察到各时间段实验组48h组和72h组成纤维细胞分泌I型胶原蛋白的水平显著低于空白对照组(P<0.05)。结论IL-13促进成纤维细胞的增殖,IL-13促进成纤维细胞分泌胶原,IL-13促进成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA水平和蛋白水平的表达。成纤维细胞表达IL-13受体α1,IL-13作用成纤维细胞2小时后转录因子STAT6磷酸化蛋白的表达增强。酪氨酸酶抑制剂来氟米特A77 1726阻断IL-13对成纤维细胞的促增殖作用,阻断IL-13对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用,阻断IL-13促成纤维细胞I型胶原α1基因mRNA水平和蛋白水平的表达。干扰素-γ抑制IL-13对成纤维细胞的促胶原蛋白合成作用。