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背景子宫内膜异位症是指具有活性的内膜细胞生长在子宫内膜以外部位所引起的疾患,属于中医血瘀证范畴,治法当以活血化瘀为主。内异消来源于中医经典妇科名方“佛手散”,是本实验室创制的抗子宫内膜异位症的中药新药,由川芎嗪、阿魏酸配以延胡索乙素组成,我们前期发现内异消对自体移植子宫内膜异位症有一定的疗效,但在异体移植模型上的作用尚未阐明。结合网络药理学方法,有利于系统地分析内异消对子宫内膜异位症的作用机制。侵袭转移被认为是子宫内膜异位症发生的重要步骤之一,上皮间质转化与侵袭转移密切相关,而Wnt通路能促进上皮间质转化。因此,本研究首先观察了内异消对异体移植子宫内膜异位症的疗效,然后从调控Wnt通路、上皮间质转化和侵袭转移的角度探讨其作用机制。最后运用网络药理学方法,进一步挖掘内异消抑制子宫内膜异位症的潜在作用机制,为内异消治疗子宫内膜异位症提供依据。目的在荧光异体移植子宫内膜异位症模型上验证内异消是否具有抑制子宫内膜上皮间质转化,进而抑制内膜侵袭转移的作用,且其作用机制是否与Wnt通路相关,并运用网络药理学方法进一步挖掘内异消作用于子宫内膜异位症的潜在靶点。方法1.荧光异体移植子宫内膜异位症模型的改进选取处于动情期的8～10周龄雌性C3H tdTomato小鼠,取双侧子宫,剪成4 mm2大小的组织块移植于裸鼠的腹部皮下,手术后每5 d肌肉注射2 mg·kg-1苯甲酸雌二醇一次。造模28 d后,于活体成像系统下检测异位病灶的荧光强度,游标卡尺测量并根据公式:体积=0.52×长×宽×高,计算异位病灶的体积,然后构建异位病灶荧光强度与体积的关系曲线,HE染色观察异位病灶的组织结构,免疫组化检测异位病灶中子宫内膜异位蛋白ENDO-I的表达。2.内异消抑制子宫内膜异位症的药效学研究在造模28 d后,将造模成功的动物根据荧光强度随机分为模型组、内异消低、中、高剂量组和孕三烯酮组,另设正常雌性C3H tdTomato小鼠为空白对照组,空白对照组和模型组给予0.5%羧甲基纤维素钠混悬液,内异消低、中、高剂量组分别给予90、180、360 mg·Kg-1内异消,孕三烯酮组给予2 mg·Kg-1孕三烯酮,连续28 d每天灌胃给药一次。给药结束后,检测异位病灶的荧光强度和体积,HE染色观察异位内膜组织结构的变化,ELISA法检测血清中E2和PROG水平的变化。3.内异消抑制异位内膜侵袭转移及上皮间质转化的机制研究取空白对照组子宫内膜、模型组以及内异消各组异位组织,提取RNA和蛋白,用RT-qPCR法检测侵袭转移MMP-2、MMP-9、TIMP-1基因和上皮间质转化E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Twist、Snail、Slug、ZEB1基因的表达,Western blot法检测侵袭转移MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白及上皮间质转化E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达。4.内异消调控异位内膜Wnt通路的机制研究取空白对照组子宫内膜、模型组以及内异消各组异位组织,提取RNA和蛋白,用RT-qPCR法检测Wnt通路APC、GSK3β、β-catenin、c-Myc、CyclinD1基因的表达,Western blot法检测Wnt3a、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、c-Myc蛋白的表达。5.内异消抑制子宫内膜异位症的网络药理学研究运用TCMID、TCMSP和SEA数据库收集内异消各成分的作用靶点,OMIM、DisGeNET和GEO数据库收集子宫内膜异位症的靶点。通过Cytoscape 3.5.0软件构建“内异消成分-靶点”和“内异消靶点-子宫内膜异位症靶点”网络,运用Network Analyzer插件分析网络的拓扑参数,计算出所有靶点的度及中介中心性的平均值,筛选出网络中的关键节点,通过DAVID及PANTHER数据库对关键靶点进行GO及通路富集分析,运用Sybyl-X 2.1.1软件将内异消各成分与部分关键靶点进行分子对接验证。结果1.荧光异体移植子宫内膜异位症模型的改进造模28 d后,裸鼠腹部皮下的异位病灶可见较强荧光,荧光强度≥9.58E+6,开腹后肉眼可见病灶呈透明的囊状,表面有丰富的血管形成,内有积液,积液高度≥1 mm,异位病灶体积≥4 mm3。异位病灶荧光强度与体积的线性关系公式为y=862154x+6.13E+6,R2=0.9005。HE染色显示,异位病灶中有子宫内膜上皮细胞、腺体及间质的生长,免疫组化结果表明,在异位内膜间质细胞的胞浆可见ENDO-I蛋白的表达,说明荧光异体移植子宫内膜异位症模型改进成功。2.内异消能抑制子宫内膜异位症给药28 d后发现,模型组给药前后,异位病灶的荧光强度和体积没有显著变化（P>0.05）。与给药前相比,内异消各组异位病灶的荧光强度和体积均显著降低（P<0.05）,孕三烯酮也能显著减小异位病灶的荧光强度和体积（P<0.01）。HE染色结果显示,模型组异位内膜具有与正常子宫内膜相似的结构,单层上皮细胞呈柱状排列,且内膜壁较厚,腺体数较多,血管丰富,有炎性细胞的浸润。给予360mg·Kg-1内异消后,异位内膜壁明显变薄,腺体及血管的数量明显减少,炎性细胞的浸润也减少。ELISA结果表明,与空白对照组相比,模型组血清中E2、PROG含量显著升高（P<0.05）,与模型组相比,内异消能显著降低血清中E2及PROG水平（P<0.05）。以上结果表明,内异消对子宫内膜异位症具有较好的疗效。3.内异消抑制侵袭转移和上皮间质转化（1）RT-qPCR结果表明,与空白对照组相比,模型组MMP-2、MMP-9 mRNA水平显著升高（P<0.01）,TIMP-1 mRNA水平显著降低（P<0.05）。与模型组相比,内异消显著下调MMP-2、MMP-9基因的表达（P<0.05）,显著上调TIMP-1基因的表达（P<0.05）。Western blot结果表明,与空白对照组相比,模型组MMP-2、MMP-9蛋白的表达显著增加（P<0.05）,TIMP-1蛋白的表达显著减少（P<0.05）。与模型组相比,内异消显著抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表达（P<0.05）,显著增加TIMP-1蛋白的表达（P<0.05）。（2）RT-qPCR结果显示,与空白对照组相比,模型组E-cadherin mRNA水平显著下降（P<0.01）,N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail、ZEB1 mRNA水平显著上升（P<0.05）。与模型组相比,内异消显著上调E-cadherin基因的表达（P<0.05）,显著下调N-cadherin、Vimentin、Twist、Slug、Snail、ZEB1基因的表达（P<0.05）。Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组E-cadherin蛋白水平显著降低（P<0.05）,N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白水平显著升高（P<0.05）。与模型组相比,内异消显著促进E-cadherin蛋白的表达（P<0.05）,显著抑制N-cadherin、Vimentin、Snail蛋白的表达（P<0.05）。4.内异消调控Wnt通路RT-qPCR结果表明,与空白对照组相比,模型组APC、GSK3β基因的表达显著减少（P<0.05）,β-catenin、c-Myc、CyclinD1基因的表达显著增加（P<0.05）。与模型组相比,内异消显著升高GSK3β、APC mRNA水平（P<0.05）,显著降低β-catenin、c-Myc、CyclinD1 mRNA水平（P<0.05）。Western blot结果表明,与空白对照组相比,模型组GSK3β、p-β-catenin蛋白的水平显著下调（P<0.05）,Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白的水平显著上调（P<0.05）。与模型组相比,内异消显著上调GSK3β、p-β-catenin蛋白的表达（P<0.05）,显著下调Wnt3a、p-GSK3β、β-catenin、c-Myc蛋白的表达（P<0.05）。5.内异消抑制子宫内膜异位症的网络药理学研究通过数据库收集得到内异消靶点275个,子宫内膜异位症靶点401个,二者共同靶点22个,构建了“内异消成分-靶点”和“内异消靶点-子宫内膜异位症靶点”网络,由22个共同靶点及其邻居节点构成的核心蛋白质-蛋白质相互作用网络,分析得到66个关键靶点。GO分析结果显示,66个关键靶点主要参与凋亡过程的负调节、DNA模板化、代谢等生物过程,主要存在于核、细胞质、细胞膜中,并具有蛋白质结合、酶结合、信号转换等分子功能。通路富集分析结果显示,关键靶点主要参与调控PI3K-Akt signaling pathway,Estrogen signaling pathway,TNF signaling pathway,Apoptosis signaling pathway,Wnt signaling pathway,VEGF signaling pathway等。分子对接结果显示,阿魏酸与IL6、MMP-2具有较好的结合活性,与TP53、MMP-9及VEGFA具有一定的结合活性;延胡索乙素与MMP-2、IL8具有较好的结合活性,与VEGFA、TIMP-1具有一定的结合活性;川芎嗪与各靶点的对接得分值均较低,无结合活性。结论综上所述,体内实验表明,在荧光异体移植子宫内膜异位症模型中,构建了异位病灶荧光强度与体积的关系曲线,R2=0.9005。内异消能显著降低异位病灶的荧光强度和体积,改善异位内膜组织结构的病理变化,降低血清中E2和PROG含量,其作用机制可能与内异消调节Wnt通路,影响上皮间质转化,进而抑制子宫内膜发生侵袭转移有关。网络药理学研究也表明,内异消作用于子宫内膜异位症的关键靶点有66个,其中包含了侵袭转移靶点MMP-2、MMP-9和TIMP-1,并可参与调控包括Wnt通路在内的多个信号通路过程,内异消中阿魏酸、延胡索乙素与包括侵袭转移因子在内的多个关键靶点有结合活性。