蜱是以吸血为生的蛛形纲体外寄生虫，是全球范围仅次于蚊子的第二大病原传播媒介。蜱能够传播多种病原体，这些病原体能引起人、驯养动物以及野生动物严重的疾病，甚至导致死亡。经蜱传播的病原体有真菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、细菌和原虫等。在畜牧业生产中，蜱及蜱传病是造成巨大经济损失的重要疾病。亚洲璃眼蜱是三宿主蜱，广泛分布于我们的新疆、内蒙和宁夏以及中亚各地区，可传播新疆出血热和Q热。控制蜱的传统方法是使用杀虫剂，但药物残留等问题日益突出，因此寻求更加健康环保的抗蜱方法迫在眉睫。蜱在吸食血液的过程中唾液腺会分泌大量活性物质，这些活性物质可阻碍宿主的凝血功能、调节宿主免疫应答及促进病原体的发育繁殖，对蜱成功饱血及病原体传播作用重大。因此，唾液腺中的活性物质是蜱研究的重点内容。在生物的凝血过程中，丝氨酸蛋白酶是一类极为重要的功能分子，同时，机体也存在丝氨酸蛋白酶的负调控分子——丝氨酸蛋白酶抑制分子。Kunitz家族蛋白是一类重要的丝氨酸蛋白酶抑制分子，普遍存在于多种生物体内，拥有一个或多个Kunitz结构域，具有抗凝血等生物性功能。有研究已证明，Kunitz是肩突硬蜱唾液腺中含量最丰富的蛋白质之一，蜱利用Kunitz蛋白与其他唾液腺蛋白共同抵抗宿主的凝血和免疫反应，促进饱血过程。亚洲璃眼蜱唾液腺Kunitz蛋白还缺少研究。本实验通过基因克隆的方法从亚洲璃眼蜱唾液腺中获得两个含Kunitz功能域的分子B26和P15。为探明B26和P15基因的生物学作用机制和特点，本研究将这两个基因进行原核表达，获得这两个基因编码的抗凝血活性物质，并对其活性进行初步研究。同时检测其在蜱不同发育阶段及各组织器官表达特征。然后通过免疫保护和抗蜱疫苗试验对其编译的抗凝血物质进行动物活体验证。最后运用RNAi沉默基因，进一步分析B26和P15基因对亚洲璃眼蜱的吸附率、饱血时间、饱血重量等吸血功能相关指标的影响。结果表明P15融合蛋白对Trypsin有明显抑制作用。与GST蛋白相比，B26融合蛋白的APTT凝血时间明显延长，P15融合蛋白的APTT凝血时间有一定的延长但差异不明显。动物疫苗实验表明：免疫P15融合蛋白的兔子接种若蜱后，24h吸附率和饱血时间明显降低（P<0.001），免疫B26融合蛋白的兔子接种若蜱后，饱血重量明显降低（P<0.001）。RT-PCR结果表明B26基因在幼蜱阶段和唾液腺表达量最高，P15基因在卵和血淋巴中表达量最高。RNAi表明，B26和P15基因均对亚洲璃眼蜱24h吸附率有明显降低。综上所述，B26和P15与蜱的吸血生物学功能密切相关。