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酪氨酸酶是人体中黑色素生成代谢与儿茶酚胺密切相关的关键限速酶,酪氨酸酶活性物质已在治疗色素障碍类疾病、防腐保鲜、美白和乌发等方面得到了广泛的应用。由于人工合成酪氨酸酶活性物质的副作用,人们更趋向于寻求无毒并且有效的酪氨酸酶活性物质。目前筛选天然酪氨酸酶活性物质存在工作量大、费时费力,且在分离过程中容易被氧化等问题。HPLC在线筛选方法具有筛选迅速、操作简单等优点,能够快速有效地发现天然产物中酪氨酸酶活性物质。本文以白芍、桑白皮为材料,应用本实验建立的在线筛选方法快速筛选提取物中酪氨酸酶活性物质,并活性追踪目标化合物分离。本文研究的主要内容与结果如下:1.对白芍和桑白皮的石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相的酪氨酸酶活性作用进行了研究。结果表明,白芍和桑白皮各相萃取物对酪氨酸酶均有不同程度的抑制活性,其中白芍的乙酸乙酯相和正丁醇相对酪氨酸酶的抑制活性较强,其IC50值分别为0.97mg/mL、2.62 mg/mL,桑白皮的乙酸乙酯相对酪氨酸酶的抑制活性最强,其IC50值为1.71mg/mL。2.应用本实验建立的在线HPLC柱后衍生筛选酪氨酸酶活性物质的方法,对白芍的乙酸乙酯相与正丁醇相和桑白皮的乙酸乙酯相分别进行了酪氨酸酶活性物质的在线筛选。结果表明,从白芍的乙酸乙酯相和正丁醇相中共筛选得到6个具有酪氨酸酶抑制活性作用的化合物,利用各种分离手段,分离得到4个活性成分;从桑白皮的乙酸乙酯相中筛选到1个对酪氨酸酶具有抑制作用的化合物,综合各种分离手段,得到1个活性成分。3.综合运用中压柱色谱和制备高效液相色谱等多种分离手段以及波谱鉴定方法(1H NMR、13C NMR),根据活性追踪,对白芍的乙酸乙酯相、正丁醇相和桑白皮的乙酸乙酯相中的酪氨酸酶抑制活性成分进行了目标分离,从白芍中分离得到4个活性成分,分别为没食子酸(BS-1)、五倍酰葡萄糖(BS-2)、1,1’,6,6’-二没食子酰基-O-β-D吡喃葡萄糖苷(BS-3)和没食子酰基-O-β-D吡喃葡萄糖(BS-4);从桑白皮中分离得到了1个活性物质,为5,7,2′-三羟基二氢黄酮-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(S-5)。4.采用96孔板法对分离得到的5个活性成分进行酪氨酸酶的活性测定,结果表明,没食子酸(BS-1)、五倍酰葡萄糖(BS-2)、没食子酰基-O-β-D吡喃葡萄糖(BS-3)、1,1’,6,6’-二没食子酰基-O-β-D吡喃葡萄糖苷(BS-4)和5,7,2′-三羟基二氢黄酮-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(S-5)均表现出酪氨酸酶抑制作用,其中以五倍酰葡萄糖(BS-2)的抑制最强,其IC50值为0.0365 mmol/L。对五倍酰葡萄糖(BS-2)的动力学研究表明,其抑制机理为可逆抑制作用,抑制类型为线性混合型抑制。