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弯曲菌(Campylobacter spp.)是引起人类急性细菌性胃肠炎最常见的原因之一。该菌主要导致人急性胃肠炎,并有可能进一步引发格林巴利综合征、急性神经肌肉瘫痪和反应性关节炎等其他疾病。近年来的研究结果显示,弯曲菌对抗生素的耐药性逐渐增强,其耐药性可通过食物链传播到人群,因此,对弯曲菌、特别是耐药性弯曲菌在动物性食品生产链中的分布和传播情况进行研究,对食品安全具有重要意义。本实验在从四川省某重点肉鸡屠宰加工厂分离鉴定的301株弯曲菌的基础上,进行耐药性分析、整合子/基因盒、gyrA基因突变位点、tetO、23S rRNA突变位点的PCR检测以及PFGE分型,主要结果如下。1.肉鸡屠宰过程中弯曲菌的分离鉴定2012年至2013年,从肉鸡屠宰加工过程中采集屠宰肉鸡盲肠样(代表屠宰前鸡粪样)、屠宰过程中肉鸡胴体表面和胴体分割后鸡肉表面样品共651份,按照GB/T4789.9—2008的方法,从肉鸡屠宰过程中分离弯曲菌疑似菌株,并以弯曲菌属的16S rRNA基因、结肠弯曲菌的ceuE基因和空肠弯曲菌的hipO基因为靶基因设计三对特异性引物,对疑似菌株进行三重PCR鉴定。结果显示,从肉鸡屠宰过程中准确鉴定出301株弯曲菌,其中,空肠弯曲菌160株、结肠弯曲菌130株,弯曲菌属其他菌种11株,弯曲菌的总分离率为46.24%,空肠弯曲菌和结肠弯曲菌占分离株的96.35%,其中屠宰前鸡粪样、净膛后肉鸡胴体表面、胴体分割后鸡肉表面弯曲菌的分离率分别为56.10%、31.00%、17.00%。2.肉鸡屠宰过程中弯曲菌的耐药性分析采用琼脂稀释法,对301株弯曲菌进行8种抗生素的耐药性分析,结果表明弯曲菌对环丙沙星的耐药率最高,达到93.02%,对四环素、左氧氟沙星、林可霉素的耐药率较高,分别为87.71%、87.71%、80.07%,对庆大霉素(67.11%)、红霉素(49.50%)、链霉素(31.89%)的耐药率居中,对氟苯尼考(13.29%)的耐药率较低,共产生52种耐药谱,多重耐药率为93.69%；其中屠宰前鸡粪样、净膛后肉鸡胴体表面、分割后鸡肉表面弯曲菌的耐药谱分别为52种、8种、2种。3.多重耐药弯曲菌耐药基因检测(1)多重耐药弯曲菌的整合子/基因盒系统分析150株多重耐药弯曲菌中第1类整合子检出率为98.67%(148/150)。其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌整合子阳性率分别为98.72%(77/78)、98.53%(67/68)；肉鸡屠宰前鸡粪样、屠宰过程中胴体表面和胴体分割后鸡肉表面的弯曲菌分离株整合子检出率分别为98.04%、100.00%、100.00%。148株整合子阳性菌株中有78株扩增出基因盒,测序结果表明,整合子基因盒编码为aadA2基因盒(氨基糖苷类抗生素的耐药基因)。(2) gyrA基因突变位点检测利用MAMA PCR技术,针对弯曲菌的gyrA基因设计一对引物,并针对257位发生点突变的序列设计一条突变引物,检测145株耐喹诺酮类药物的弯曲菌gyrA基因257位碱基的突变情况。结果显示,有135株在gyrA处发生突变,突变率为93.10%。其中耐喹诺酮类药物的空肠弯曲菌和结肠弯曲菌gyrA基因257位碱基的突变率分别为97.26%(71/73)、89.71%(61/68)；对喹诺酮类药物敏感的菌株检测不到这种突变。测序结果表明,对环喹诺酮类药物耐药的菌株12-JF156和12-JF181在第257位碱基发生了C-T的突变,直接导致原来编码的苏氨酸突变为异亮氨酸；对喹诺酮类药物敏感的菌株12-JF19和13-JF60,在257位均未发生C-T突变。(3) tetO基因检测对130株耐四环素的弯曲菌进行tetO基因的PCR扩增,结果表明,共123株菌株检测出该基因,检出率为94.62%(123/130),其中空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和其他弯曲菌tetO基因的检出率分别为96.61%(57/59)、94.12%(64/68)、66.67%(2/3)。(4) 23S rRNA突变位点的PCR检测针对弯曲菌23S rRNA的V区设计一条引物,并针对2075突变位点设计一条引物,用于检测突变菌株。对83株耐红霉素的菌株,进行PCR扩增,结果显示,80株菌在2075处发生突变,突变率为96.39%(80/83),其中空肠弯曲菌、结肠弯曲菌和其他弯曲菌在2075处发生突变的突变率分别为95.00%(19/20)、96.72(59/61)、100.00%(2/2),对红霉素敏感的菌株未检测到突变。4.肉鸡屠宰过程中弯曲菌的PFGE分型采用Sma I对150株多重耐药弯曲菌进行PFGE分型研究,通过软件的聚类分析,78株空肠弯曲菌PFGE条带之间相似度在42.10%～99.14%之间,产生了33种不同基因型,68株结肠弯曲菌PFGE条带之间相似度在54.01%-99.74%之间,产生了15种基因型,4株其他弯曲菌PFGE条带之间相似度在43.24%～66.12%之间,产生了4种不同的谱型；谱型分析结果表明,弯曲菌在鸡肉屠宰加工过程中(屠宰前鸡粪样-净膛后肉鸡胴体表面-胴体分割后鸡肉表面)存在从上游环节到下游环节传播的现象。本文对肉鸡屠宰过程中弯曲菌的污染和耐药性做了详细分析,并对多重耐药菌株进行整合子/基因盒、gyrA基因突变位点、tetO、23S rRNA突变位点的PCR检测以及PFGE分型,为研究肉鸡屠宰过程中弯曲菌的污染及传播机制奠定了基础,并为研究弯曲菌耐药性的产生机制提供参考,具有一定的理论意义和实际应用价值。