己酮可可碱对神经病理性疼痛大鼠的镇痛作用及机制研究　　 中枢或外周神经系统损伤或功能障碍可引起以自发痛( Spontaneous Pain)、痛觉过敏(Hyperalgesia)（增强的对痛刺激的反应）及痛觉超敏(Allodynia)（不致痛的刺激引起的疼痛）为特征的神经病理性疼痛(Neuropathic Pain)。神经病理性疼痛发生机制复杂，难于治疗，严重干扰患者的日常生活。目前临床神经病理性疼痛的治疗策略主要是对神经原功能的调控，如：调控离子通道来降低外周或中枢神经原的兴奋性（抗癫痫药、局麻药、辣椒素），或者增强内源性抑制系统的作用（抗抑郁药、曲马多、阿片药），但仅40％-60%患者获得部分缓解，因此进一步深化对神经病理性疼痛发生机制的理解，探寻新的治疗药物是未来神经病理性疼痛治疗的重要研究方向。近年来，越来越多的研究证实胶质细胞主导的神经炎症和神经免疫反应在神经病理性疼痛的发生、维持中发挥重要作用，因此调控胶质细胞功能，控制过度的神经炎症成为目前神经病理性疼痛研究及药物开发的一个热点。　　 己酮可可碱是一种非特异的磷酸二酯酶抑制剂，体外试验证实其能抑制脂多糖刺激的小胶质细胞、星形胶质细胞的活化，减少促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的释放。此外在急性炎性疼痛的研究中，己酮可可碱通过抑制局部TNF-α的释放，预防足底注射福尔马林引起的疼痛。本研究通过大鼠腰5脊神经切断神经病理性疼痛模型，观察预防及治疗性腹腔注射己酮可可碱，对神经病理性疼痛大鼠的行为学以及对脊髓、脑胶质细胞活化、炎症细胞因子释放的影响。　　 第一部分预防性给予己酮可可碱在腰5脊神经切断大鼠中的镇痛作用及机制研究　　 一、预防性给予己酮可可碱对神经病理性大鼠行为学影响　　 56只大鼠随机分入7组：(1)己酮可可碱100mg/kg预给药手术组；(2)己酮可可碱50mg/kg预给药手术组；(3)己酮可可碱25mg/kg预给药手术组;(4)己酮可可碱12.5mg/kg预给药手术组；(5)生理盐水预给药手术组；(6)己酮可可碱100mg/kg预给药假手术组；(7)生理盐水预给药假手术组。所有大鼠术前lh及术后每日，腹腔注射相应剂量药物一次，测量术前及术后1、4、7天机械、热痛觉改变。结果：己酮可可碱100mg/kg不影响假手术大鼠行为学。与假手术大鼠相比，神经损伤大鼠出现明显的机械、热痛高敏。与生理盐水预给药手术组相比，预防性腹腔注射己酮可可碱50或100mg/kg，能明显缓解大鼠的机械、热痛高敏行为。　　 二、预防性给予己酮可可碱镇痛作用机制研究　　 （一）脑及脊髓炎性细胞因子的改变　　 采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定术后第7天各组大鼠前额叶和腰5脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-6、及IL-IO的水平。结果：与假手术组相比，神经损伤大鼠脑及脊髓TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显增高，IL-10水平仅己酮可可碱50、100mg/kg组明显升高。与生理盐水处理手术组相比，己酮可可碱50、100mg/kg组脑及脊髓组织TNF-α、IL-1β及IL-6水平明显减低，而IL-10水平明显升高。　　 （二）脑及脊髓NF-KB活性的变化　　 采用凝胶电迁移法(EMSA)测定术后第7天各组大鼠前额叶和腰5脊髓组织核因子-κB(NF-κB)活性。结果：与假手术组相比，神经损伤大鼠脑及脊髓NF-κB活性明显增高。与生理盐水处理手术组相比，己酮可可碱50、100mg/kg组脑及脊髓NF-κB活性明显减低。　　 （三）脑及脊髓胶质细胞表面标志物分子mRNA水平变化　　 采用实时定量聚合酶链反应法(RT-PCR)测定术后第7天各组大鼠前额叶和腰5脊髓胶质细胞表面标志物Toll样受体-4(TLR-4)、白细胞分化抗原11b(CD11b)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)及看家基因β肌动蛋白(β-actin)的相对表达量，计算出三种标志物mRNA标准化表达水平。结果：与假手术组相比，神经损伤大鼠脑及脊髓TLR-4、CD11b及GFAP的mRNA表达明显增加。与生理盐水处理手术组相比，己酮可可碱50、100mg/kg组脑及脊髓TLR-4、CD11b及GFAP的mRNA表达明显减低。　　 第二部分己酮可可碱治疗腰5脊神经切断大鼠的效果及分析　　 一、己酮可可碱治疗神经病理性大鼠的行为学效应　　 32只大鼠随机分为4组：(1)假手术组；(2)生理盐水治疗组；(3)己酮可可碱50mg/kg治疗组；(4)己酮可可碱100mg/kg治疗组。各组大鼠术后第7天开始分别接受上述药物治疗，测量术前及术后1、4、7、10、12、14天机械、热痛觉改变。结果：与假手术组相比，神经损伤大鼠术后出现明显的机械、热痛高敏。与生理盐水治疗组相比，己酮可可碱不能缓解大鼠痛高敏行为。　　 二、效应分析　　 （一）脊髓炎性细胞因子的变化　　 采用ELISA测定术后第14天各组大鼠腰5脊髓组织TNF-α、IL-1β、IL-6、及IL-10的水平。结果：与假手术组相比，神经损伤大鼠脑及脊髓TNF-α、IL-1β)及IL-6水平明显增高，己酮可可碱100mg/kg组IL-10水平明显增高。与生理盐水治疗组相比，己酮可可碱组与其无显著差异。　　 （二）脊髓NF-κB活性的变化　　 采用EMSA测定术后第14天各组大鼠腰5脊髓组织NF-κB活性。结果：与假手术组相比，神经损伤大鼠脑及脊髓NF-κB活性明显增高。与生理盐水治疗组相比，己酮可可碱组与其无显著差异。　　 （三）脊髓胶质细胞表面标志物分子mRNA水平变化　　 采用RT-PCR测定术后第14天各组大鼠腰5脊髓组织胶质细胞表面标志物TLR-4、CD11b及GFAP的mRNA表达水平。结果：与假手术组相比，神经损伤大鼠脑及脊髓TLR-4、CD11b及GFAP的mRNA表达明显增加。与生理盐水治疗组相比，己酮可可碱组无显著差异。　　 结论　　 本研究观察了预防及治疗性给予己酮可可碱对腰5脊神经切断大鼠痛行为学的作用，以及对脑、脊髓组织炎症细胞因子、NF-κB活性和胶质细胞表面标志物分子mRNA水平的影响，发现己酮可可碱仅能预防神经病理性疼痛的发生，不能治疗已发生的神经病理性疼痛，而且其效应与抑制胶质细胞活化，降低NF-κB活性，减少促炎细胞因子释放相关。本研究证实了中枢小胶质细胞和星形胶质细胞主导的“神经炎症”在神经病理性疼痛发生、维持中的重要作用，同时也提示磷酸二酯酶抑制剂“调控胶质细胞”治疗神经病理性疼痛的前景。