目前,石油、煤炭等非可再生资源被大量开发使用,使得其逐渐不能满足人类经济的高速发展。因此寻求探索新型绿色的可再生资源已经成为亟待解决的问题。而现代生物技术的进一步发展使得将木质纤维素生物质转化为液体燃料从而进一步有效缓解资源短缺问题成为可能。丝状真菌作为表达木质纤维素酶的重要工业菌株将其用于生物质降解进而缓解资源问题具有重大应用前景,但目前木质纤维素酶的生产成本仍然较高。因此,探索丝状真菌木质纤维素酶的表达代谢调控机制,对于进一步提高其表达水平进而应用于工业生产具有重要的科学意义及应用价值。草酸青霉（Penicillium oxalicum）是表达木质纤维素酶的重要丝状真菌。在草酸青霉的纤维素酶表达调控体系中,调控蛋白在纤维素酶基因转录水平的调控过程中发挥了重要的作用。而纤维素酶转录因子及其互作的调控蛋白是纤维素酶表达调控体系的重要组成部分。因此,探索草酸青霉纤维素酶转录因子及其互作蛋白,对于系统解析纤维素酶表达调控网络具有重要意义。本论文利用酵母双杂交技术以及串联亲和纯化技术,初步筛选到多种与纤维素酶主要转录调控因子Htf、ClrB2、CreA、ClrB、AmyR以及XlnR相互作用的蛋白,为全面构建转录因子调控纤维素酶合成的调控网络奠定了基础。转录因子调控纤维素酶表达的机理主要是通过招募相关蛋白等,改变启动子区域的染色质结构,从而对靶标基因表达进行调控。染色质重塑蛋白复合物在转录因子招募蛋白的过程中发挥作用。因此,本论文另一方面的工作是初步研究草酸青霉主要的染色质重塑蛋白基因在纤维素酶表达中发挥的功能。本论文的主要研究内容和结果如下:1.利用酵母双杂交技术筛选转录因子Htf的相互作用蛋白为了筛选与草酸青霉转录因子Htf相互作用的蛋白,首先构建了Y2HGold-PGBKT7-Htf酵母菌株,通过酵母双杂交技术,与草酸青霉蛋白质组文库菌株Y187-PGADT7-cDNA的表达互作实验,初步筛选与Htf蛋白互作的蛋白质。同时,对筛选到的与Htf互作的蛋白质的功能进行了初步研究。本研究通过酵母双杂交技术,发现了 5个可能与转录因子Htf相互作用的蛋白。这些蛋白编码基因分别是 PDE₀1231、PDE₀2486、PDE 04682、PDE₀6164、PDE₀8762。预测发现,PDE₀1231的N端含有一个类似GAL4的C6锌双核簇DNA结合结构域,可能在调控基因表达、复制等过程中发挥作用。转录因子PDE₀2486含有LSM结构域,可能参与SnRNP的组装,负责对mRNA的剪接。功能预测发现,PDE₀4682为GPI-膜锚定蛋白超家族成员,可能在MAPK信号传导途径中起作用。PDE₀6164作为PRP1-N超家族蛋白,可能参与mRNA的剪接以及RNA出核过程。PDE₀8762作为MFS超家族蛋白,涉及次级转运的过程。通过以草酸青霉114-2为出发菌株构建PDE₀1231基因重组菌株,研究发现该蛋白对草酸青霉纤维素酶表达调控无明显的作用。利用酵母双杂交技术初步筛选到的这5个可能与Htf有相互作用的蛋白,其蛋白间的相互作用仍需细胞内实验验证。2.利用串联亲和纯化技术筛选纤维素酶主要转录因子的相互作用蛋白为全面了解蛋白质相互作用在纤维素酶表达调控中的作用机制,本论文又采用串联亲和纯化技术（TAP）,进一步挖掘与草酸青霉5种主要转录调控因子ClrB2、CreA、ClrB、AmyR以及XlnR有相互作用的蛋白。首先,以草酸青霉114-2作为出发菌株,构建了 5种转录因子加FLAG-HA标签的菌株。通过TAP实验的两步亲和纯化,靶取到与标签转录因子蛋白互作形成的蛋白复合物。然后利用质谱技术鉴定获得的5种转录因子的互作蛋白。研究发现,PDE₀1024编码的RcoA蛋白和PDE₀3177编码的Cyc8蛋白同时存在于与ClrB和AmyR相互作用的蛋白体系中。PDE₀1024编码的RcoA蛋白具有两个保守的结构域:N端为Tup结构域,C端为WD40结构域。RcoA可能在组蛋白结合、组蛋白脱乙酰化酶结合、阻遏转录过程中发挥功能。PDE₀3177编码的Cyc8蛋白含有一个SNAP超家族及TPR重复结构域。Cyc8可能通过与Tup蛋白结合形成共抑制物,参与转录、染色质重塑以及结合组蛋白去乙酰酶,参与核小体定位的多种生物过程。PDE₀9266编码的Swi6蛋白存在于与ClrB的相互作用蛋白体系中。Swi6蛋白含有ANK超家族结构域以及KilA-N结构域。ANK结构域具有锚蛋白功能,可以重复介导不同的蛋白质家族中的蛋白质-蛋白质相互作用。KilA-N结构蛋白可以结合于靶基因上游调控序列,调控细胞的生长发育。PDE₀8646编码的未知功能蛋白存在于与CreA的相互作用蛋白体系中。PDE₀8646蛋白N端含有GAL4类似的锌指双核DNA结合结构域,但其生物功能未知。通过对草酸青霉5种主要转录调控因子ClrB2、CreA、ClrB、AmyR以及XlnR的相互作用蛋白质进行系统分析,发现除ClrB2转录因子加标签菌株外,其余标签菌株通过TAP实验均靶取到了各自转录调控因子的互作蛋白。利用TAP技术筛选到的蛋白主要分为四类:催化蛋白、结构蛋白、运输蛋白以及其他类蛋白。其中标签菌株TAP实验筛选到的催化蛋白比例较阴性对照菌株有所降低,但糖苷水解酶的比例有所提高,包括β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶等。筛选到的结构蛋白,运输蛋白比例同样有所降低,而其他类蛋白所占的比例升高。通过串联亲和纯化技术对纤维素酶转录调控因子相互作用蛋白体系的挖掘,对草酸青霉纤维素酶转录因子调控网络的探索具有重要意义。3.染色质重塑蛋白参与纤维素酶表达调控的研究染色质重塑蛋白复合物在转录因子调控基因表达时发挥作用。为探索草酸青霉中染色质重塑蛋白在纤维素酶表达调控中的作用,以草酸青霉114-2作为出发菌株,以酿酒酵母染色质重塑蛋白的同源蛋白为基础,分别选择了草酸青霉的染色质重塑蛋白基因PDE₀4736、PDE₀7819、PDE₀8304作为研究对象。构建草酸青霉染色质重塑蛋白敲除株以及过表达菌株,对敲除株以及过表达菌株进行表型分析和纤维素酶酶活测定,分析染色质重塑蛋白在纤维素酶表达调控中的作用。研究发现,染色质重塑蛋白基因PDE₀4736、PDE₀7819、PDE₀8304的敲除,对草酸青霉生长发育以及纤维素酶的表达影响较小。过表达PDE₀4736以及PDE₀8304使得草酸青霉纤维素酶活有一定程度提高。过表达PDE₀7819对草酸青霉生长发育以及纤维素酶的表达无明显影响。推测染色质重塑蛋白主要以复合物的形式发挥功能,缺失单一染色质重塑蛋白基因未显著影响染色质重塑复合物作用的发挥,而这可能是由其它组分蛋白的功能补偿作用而导致的。由于染色质重塑蛋白复合物的核心亚基在染色质重塑复合物中起到关键作用,因此,通过基因敲除的方式研究其核心亚基的功能相对困难。