目的:单基因糖尿病是单一基因突变引起的一种特殊类型的糖尿病。以胰岛素的基因突变为例,目前为止,人们已发现了超过50种胰岛素的基因突变可导致早发型的糖尿病。天津医科大学总医院的内分泌代谢科为深入了解单基因糖尿病,开展了一项有关单基因糖尿病的筛查工作。为探究不同的胰岛素基因(INS gene)突变的致病机制,本实验研究了其折叠、分泌功能。其次,既往的研究表明,突变所导致的错误折叠的胰岛素原可能通过与其共存的野生型胰岛素原而产生异常作用,这会影响其折叠、加工和分泌,从而进一步加剧了胰岛素的缺乏,这一现象即为错误折叠的胰岛素原对野生型胰岛素原的显性负效应。因此本研究根据以上推测,设计实验方案。方法:首先,制备带有Myc标签的野生型胰岛素原/突变胰岛素原的过表达质粒,然后将其分别转染到293T细胞中,转染48小时后收取细胞及培养基中的蛋白,统计胰岛素原含量并计算其分泌率,同时将细胞中的蛋白两等分,一半不加特殊处理,另一半加还原试剂以打开二硫键,比较不同胰岛素原存在的错误折叠情况。其次,将Myc标记的的胰岛素原与未标记的野生型胰岛素原共同转染入293T细胞中,转染48小时后,用裂解效果温和型的细胞裂解液去裂解细胞,收集细胞中的蛋白,其中10%的总蛋白作为对照,90%的蛋白进行免疫沉淀。向所得的蛋白中均加入还原试剂以打开二硫键。通过计算被免疫沉淀的未标记的野生型胰岛素原与10%的总蛋白的比率,了解不同的胰岛素原与野生型胰岛素原分子之间的相互作用。然后,再次将Myc标记的胰岛素原与未标记的野生型胰岛素原共转染至293T细胞中,转染48小时后收集细胞及培养基中的蛋白,计算无标签野生型胰岛素原的分泌率,同时将细胞中的蛋白两等分,一半无处理,另一半加入还原试剂打开二硫键,观察其错误折叠情况。最后,将带有Myc标签的野生型胰岛素原/突变胰岛素原分别单独转染到Ins1细胞中,转染24小时后进行细胞爬片,爬片24小时后进行免疫荧光。分别共染Myc+TGN38/Myc+INS,观察野生型胰岛素原/突变胰岛素原在细胞中的定位情况及其对Ins1细胞内源性胰岛素合成的影响。结果:1.不同的胰岛素的基因突变导致的临床表现的严重程度具有差异性2.胰岛素基因突变可导致胰岛素原错误折叠增多及分泌能力降低。3.突变胰岛素原可与野生型胰岛素原发生分子间相互作用。4.突变胰岛素原可影响与其共表达的野生型胰岛素原的折叠及分泌。5.突变胰岛素原主要定位在内质网并可影响Ins1细胞内源性胰岛素的合成。结论:新发现的C43Y、R46X、R55C三种突变均可与野生型胰岛素原发生分子间的相互作用。其中,C43Y、R55C突变可影响胰岛素生物合成过程中的胰岛素原折叠、加工步骤,与野生型胰岛素原之间形成错误配对的二硫键,影响野生型胰岛素原的折叠、加工,从而减少胰岛素的合成导致糖尿病的发生和(或)发展。