论文部分内容阅读
我国有74%的耕地土壤缺磷,土壤中95%以上的磷为无效磷（磷灰石）,植物很难利用;约有60%的耕地缺钾,耕地速效钾含量正以每年（2-3）×10-6的速度下降,造成土壤中氮、磷、钾3种元素比例失调,影响了农业的发展。研究如何从这些广泛分布的土壤矿物中释放出可给态的磷钾元素供给作物利用,具有很大的科学和实践意义。高效解磷解钾细菌对农作物病原菌的拮抗作用研究鲜有报道,本实验筛选解磷解钾高活性细菌中对常见病原菌有拮抗性菌株,旨在得到既高效解磷解钾,又有生防作用的多功能细菌,并通过试验室研究研制出高效微生物菌剂,为我国的农业生产服务。从全国不同地域的不同作物土壤中分离得到的297株芽孢菌中,利用平板筛选法获得了34株具有解磷或解钾作用的菌株,经过钼锑抗比色法和四苯硼钠法测定其溶磷解钾量,选取解磷解钾活性较标准菌AC10012 K-1高的菌株,其中获得3株高效解有机磷菌:NX-42、CX-14、BY-4; 15株高效解无机磷菌:BY-3、CX-9、SS-14、SS-9、BY-4、CC-14、CX-7、CX-24、SS-8、NX-43、NX-42、CX-8、CX-21、SS-12、CC-34; 12株高效解钾菌:NX-11、NX-43、CX-9、CX-8、CX-7、BY-4、SS-12、NX-23、CX-14、BY-3、NX-12、NX-42。并从以上34株菌中筛选出5株植物病原菌拮抗菌,其中从西安市长安县小麦地土壤中分离筛选出的CX-7菌株解磷解钾能力较高,并且抑菌活性高,通过生理生化反应及16S rDNA基因序列分析对CX-7菌株进行了鉴定。生理生化反应显示菌株CX-7特征与胶冻样芽孢杆菌相似。将16S rDNA序列在NCBI网站中进行同源性比较,利用Neigllbor-Joining法绘制系统发育树,结果显示CX-7菌株与Paenibacillus kribbensis的16S rDNA序列同源性达到98%,结合生理生化反应及16S rDNA基因序列分析鉴定CX-7菌株为Paenibacillus kribbensis。胶冻样类芽孢杆菌（Paenibacillus kribbensis）CX-7菌株,其解磷解钾活性分别为有机磷3.18 mg/L、无机磷71.60 mg/L、钾长石3.44 mg/L;通过玉米盆栽试验验证了CX-7菌株的应用效果,结果表明:叶面积增加5.6%,株高增高8.0%,干湿重增加率分别为21.6%和68.3%,土壤中速效钾和有效磷的含量高于对照。CX-7菌株有较好的解磷解钾应用效果,具有很好的开发前景。对CX-7菌株产芽孢条件进行摸索,为细菌进入工业化生产提供理论基础,最佳培养基为:葡萄糖0.2%,豆饼粉0.5%,NaCl 0.05%,MgSO4 0.07%,K2HPO4 0.05%,酵母膏0.05%;最佳培养条件为:种龄20 h、接种量10%、培养基初始pH值6、装量100 mL/250 mL。通过优化是芽孢生成率大幅提高,优化后芽孢生成率达到99.64%。对CX-7菌株产抗菌物质的液态发酵条件进行优化,得到了抗菌蛋白的最佳培养基组成为:蔗糖0.5%,豆饼粉0.5 %,MgSO4 0.02%,K2HPO4 0.02%,酵母膏0.07%,（NH4）2SO4 0.02%,发酵液初始pH值为7.0、装量50 mL /250 mL、最佳接种量7%、发酵周期36 h。优化前后蛋白抑菌活性差别明显,优化之前抑菌圈面积178.91 mm2,优化后为706.86 mm2,活性提高了295.09%。菌株分泌的抗菌蛋白经DEAE-SePhamse Fast Flow阴离子交换层析后,分离纯化到单一抗菌多肽,经SDS-PAGE检测分子量约为50 KDa。抗菌多肽对热稳定; pH活性范围较宽,在pH6-8范围内抑菌活性最强,在碱性条件下稳定,在强酸性条件下抑菌活性消失。