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肿瘤凋亡因子TRAIL是TNF家族的成员之一,其不论在体内还是体外均可选择性的诱导癌细胞凋亡,初期临床试验已经证实TRAIL或死亡受体激动剂抗体在癌症治疗中的安全性。另外,也有研究表明许多癌细胞对TRAIL有耐受性,究其原因是凋亡通路中抗凋亡蛋白c-FLIP和IAPs等的阻遏。近来研究发现,siRNA靶向抑制c-FLIP的同时结合广谱IAP拮抗剂AT406进一步提高了TRAIL诱导的癌细胞凋亡,因此联合使用c-FLIP抑制剂或拮抗剂、IAP拮抗剂以及TRAIL或死亡受体激动剂抗体这三类药物可能是理想的抗癌新方法。骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,主要发生在青少年患者中,它是一种快速生长且容易转移的肿瘤。骨肉瘤的形成和发展机制已经研究了很长一段时间,最近,更多的研究证据表明,c-FLIP在调节肿瘤生长中扮演着重要角色。因此,为了利用RNAi技术来研究c-FLIP在TRAIL诱导的U20S细胞凋亡中的作用,我们进行了如下实验：目的：建立稳定下调c-FLIP表达的骨肉瘤U20S细胞系,了解恶性肿瘤细胞产生耐药的生物特性和耐药机制。方法：通过构建产生siRNA的质粒pSUPER-c-FLIP-siRNA,并将该质粒和空载转染入骨肉瘤U20S细胞系,加入含终浓度为1μg/ml的Puromycin的DMEM培养基筛选6天,加入含20%FBS的DMEM培养基继续扩大培养,待细胞密度达到50%时,继续加入维持浓度0.25μg/ml的Puromycin继续培养,至筛选出稳定下调c-FLIP表达的克隆细胞并扩大培养。筛选过程中用普通光学显微镜观察细胞死亡和生长状况。分别应用Western Blot和半定量RT-PCR方法比较实验组克隆细胞和对照组转染空载的克隆细胞系中c-FLIP蛋白和mRNA水平上的差异。利用MTT方法,检测克隆细胞系U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA和对照组U2OS/pSUPER的细胞凋亡率,c-FLIP抑制剂rocaglamide预处理4h或没有预处理并结合IAPs抑制剂AT406和TRAIL作用24小时,进一步检验细胞凋亡,并绘制细胞的存活率曲线。最后,流式细胞术检测细胞凋亡全过程,利用SPSSvl9软件进行统计分析。结果：我们构建了pSUPER-c-FLIP-siRNA质粒,然后转染入U20S细胞,之后从这些转染细胞中筛选得到了稳定转染的细胞株U20S/pSUPER-c-FLIP-siRNA和U20S/pSUPER。半定量RT-PCR和Western Blot结果显示,与对照细胞U2OS/pSUPER相比,克隆细胞U2OS/pSUPER-c-FLIP-siRNA的c-FLIP表达被c-FLIP-siRNA显著抑制。同时,MTT检测结果表明,TRAIL诱导的U20S/pSUPER-c-FLIP-siRNA细胞凋亡无论有无AT406处理均比对照组U2OS/pSUPER的细胞凋亡率有所增加。流式细胞术表明TRAIL诱导的细胞死亡是经过细胞凋亡一系列过程的。然而,Rocaglamide作用下,在两种细胞中,TRAIL诱导细胞死亡都很明显且死亡率大体相同,表明c-FLIP-siRNA与Rocaglamide的作用机制是完全相同的。结论：通过利用c-FLIP-siRNA或Rocaglamide抑制c-FLIP表达均可增强TRAIL诱导的U20S细胞凋亡,表明抑制c-FLIP表达是癌症治疗的一个靶标。