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结肠癌是常见的消化道癌症之一,全球第三大癌症,全球死亡率第四。在我国结肠癌的发病率位居第四位,死亡率位居第五位,仅次于肺癌和胃癌。结肠癌5年生存率较低,治疗和预后效果较差,已经严重的影响了人类的健康。Wnt通路在生物的生长、发育和分化等多个方面发挥着重要的作用,己有的研究结果表明Wnt通路的异常表达与多种癌症密切相关,包括结肠癌。结肠癌的发生和发展与遗传因素和环境因素密切相关。现阶段在结肠癌中己经发现了 APC、β-catenin、KRAS、P53等基因突变,以及多种Wnt蛋白的异常表达。据报道Wnt6基因的多态性与结肠癌密切相关,但Wnt6对结肠癌的作用还鲜有报道。本实验拟通过研究比较正常人群结肠组织、结肠癌患者结肠癌组织和癌旁组织中Wnt6mRNA和蛋白的表达量以及Wnt6对结肠癌细胞系的影响,来初步探讨Wnt6对结肠癌发生和发展的作用,并为进一步的研究Wnt6对结肠癌发生和发展的分子机制奠定基础。第一部分结肠癌组织Wnt6的表达量目的:检测来源于正常人群的结肠组织、结肠癌患者结肠癌组织和癌旁组织中Wnt6的表达量,初步判断Wnt6与结肠癌之间的关系。方法:结肠癌组织来源于我院2015年7月至2016年7月原发性结肠癌术后病例45例,在手术时随机收取对应癌旁组织20例。收取20例经胃肠镜及其他影像学、实验实检查确诊为正常人群的少量结肠组织。45例患者中男性23例,女性22例(年龄39～68岁,平均年龄54.44 ±7.03岁)。20例正常人群中男性11例,女性9例(年龄41～62岁,平均年龄52.15 ±5.91岁)。使用t检验和卡方检验对对照组和实验组性别和年龄差异进行分析。本实验共分为3组:结肠癌组织组、癌旁组织组和正常结肠组织组。采用荧光定量PCR检测各组所有样品Wnt6的mRNA表达量。再从三组中各随机抽取8个样品,采用Western blotting检测Wnt6的蛋白表达量。结果:患者和正常人群年龄(t=1.272,p=0.208)和性别(F=0.084,p=0.772)之间的差异无统计学意义。结肠癌组织中Wnt6 mRNA的表达量显著高于正常结肠组织和癌旁组织(P<0.01)。癌旁组织中Wnt6的表达量与正常结肠组织之间的差异无统计学意义。从Western blotting的结果,可以发现随机挑选的8个样品,结肠癌组织中Wnt6蛋白的表达量高于癌旁组织和正常结肠组织。结论:高表达的Wnt6与结肠癌相关,Wnt6可能在结肠癌的发生和发展中发挥着重要的作用。第二部分shRNA干扰和过表达Wnt6载体的构建和结肠癌细胞系的选择目的:构建shRNA干扰Wnt6载体和过表达Wnt6载体,从5种结肠癌细胞系中筛选出高表达Wnt6的细胞系,用于shRNA干扰载体和过表达载体的转染,获得稳转细胞系,用于下一步的研究。方法:通过荧光定量PCR检测5种结肠癌细胞系LoVo、SW480、HCT116、SW620和HT29中Wnt6的mRNA的表达水平,挑选出高表达Wnt6的细胞系。构建shRNA干扰载体和过表达载体,用Lip02000进行HCT116和SW480细胞的转染。转染后24小时荧光显微镜下观察各组(CON、shNC、shWnt6、EV和pWnt6)绿色荧光的表达情况,并采用荧光定量PCR检测转染后各组细胞Wnt6的mRNA表达水平。结果:从荧光定量PCR结果,发现5种结肠癌细胞系中,SW620、HCT116和SW480这3种细胞系Wnt6的表达量最高,均显著性高于LoVo细胞系(P＜0.01)。而LoVo和HT29细胞系中Wnt6表达量之间的差异无统计学意义。转染shRNA干扰载体和过表达载体后24小时,在荧光显微镜下各组都可以观察到绿色荧光蛋白的表达。转染shRNA干扰载体后,HCT116和SW480细胞系Wnt6的mRNA表达水平均显著下降(P＜0.01),而转染过表达载体后HCT116和SW480细胞系Wnt6表达水平均显著升高。结论:HCT116和SW480细胞系Wnt6表达量最高,shRNA干扰载体能够有效的沉默Wnt6的表达,过表达载体能够有效地提高Wnt6的表达量。第三部分Wnt 6对HCT116和SW480两种结肠癌细胞生长的影响目的:研究Wnt6对2种结肠癌细胞系生长的影响。方法:对HCT116和SW480细胞进行shRNA干扰载体的转染,shRNA干扰载体和过表达Wnt6载体的共转染。用MTT法检测各组(CON、shNC、shWnt6、EV和shWnt6+pWnt6)细胞中Wnt6对结肠癌细胞增殖能力的影响。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡和细胞周期。采用transwell检测细胞的迁移能力以及采用Western blotting检测凋亡相关基因Bax、Caspase-3以及迁移相关基因MMP2的蛋白表达水平的变化。结果:与shNC组相比,shWnt6组结肠癌细胞增殖能力显著降低(P<0.01),细胞凋亡数目显著增加,细胞周期停滞在GO-G1期的比例显著增加,细胞周期处于S期比例显著减少,且细胞迁移能力降低,促细胞凋亡基因Bax蛋白表达水平上升,凋亡相关蛋白Caspase-3表达水平下降,促进细胞迁移基因MMP2的蛋白表达水平下降。而共转染shWnt6干扰和过表达Wnt6载体后,与转染shWnt6相比结果相反且存在显著性差异。结论:Wnt6能够促进癌细胞的生长和迁移,该作用可能通过抑制细胞的凋亡、促进细胞的迁移实现。