蛋白尿不仅是肾脏疾病的主要临床表现，其本身也作为独立的致病因子直接参与肾脏病理损害过程，导致肾功能进行性减退。研究表明，尿蛋白含量可作为反映各种原发性肾脏疾病疗效的评价指标和预后指标。如何有效降低尿蛋白，延缓肾脏病进展一直是肾病学界普遍关注的焦点之一。目前临床上对蛋白尿的治疗以糖皮质激素和免疫抑制剂为主，但两者都存在副作用大，疗效欠佳的弊端。斑蝥素(cantharidin)是从鞘翅目芫菁科昆虫斑蝥中提取的一种活性成分，在癌症治疗方面具有独特疗效。但因其毒性较大，临床应用受到限制。去甲斑蝥素(norcantharidin，NCTD)是斑蝥素的重要衍生物，具有毒性低，药理作用更明确的优点。现已证实去甲斑蝥素可抑制多种肿瘤细胞增殖，并诱导其凋亡。目前发现去甲斑蝥素诱导细胞凋亡的信号转导途径与caspase家族和Bcl-2家族密切相关，同时细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)、c—Jun N-末端激酶(JNK)和survivin蛋白也参与了此过程。另一方面，去甲斑蝥素可下调核因子κB(NF-κB)及Smad3的表达，调节基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制因子(TIMPs)的比值，从而抑制肿瘤细胞的浸润粘附及局部新生血管的形成，维持细胞外基质的合成与降解平衡。此外，去甲斑蝥素还具有抗炎，调节免疫的作用，用于治疗风湿痛、银屑病等免疫性疾病也有特效。最近还有研究发现，斑蝥素呈剂量依赖性抑制成纤维细胞株(NIH／3T3细胞)增殖，对防治器官组织纤维化也有一定作用。原发性肾小球疾病是一种免疫性疾病，蛋白尿与肾组织炎症、纤维化及相关基因的表达密切相关。结合上述斑蝥素的药理作用特点可见，用斑蝥素治疗肾脏疾病具有理论依据。因此，本研究选用去甲斑蝥素(NCTD)干预蛋白超负荷肾病大鼠，旨在观察其对模型大鼠蛋白尿及肾间质纤维化的影响，并从体内和体外实验探讨其作用机制。本论文分为四部分：第一部分为NCTD干预蛋白超负荷肾病大鼠，观察NCTD对模型大鼠蛋白尿及肾间质纤维化的影响。第二部分应用RT-PCR、免疫组化及Western blot的方法，检测NCTD对蛋白超负荷肾病大鼠结缔组织生长因子(CTGF)基因和蛋白表达水平的影响。第三部分观察NCTD对蛋白超负荷肾病大鼠核因子κB(NF-κB)表达水平的影响。第四部分观察NCTD对白蛋白刺激近端肾小管上皮细胞(HK-2)增殖及上调纤维连接蛋白(FN)表达的影响。目的：建立蛋白超负荷肾病大鼠模型，观察NCTD对肾病大鼠蛋白尿及肾脏间质纤维化的影响，并通过检测肾组织中CTGF和NF-κBp65的基因和蛋白表达水平(体内实验)，及观察NCTD对白蛋白刺激HK-2增殖及上调FN表达的影响(体外实验)，初步探讨NCTD对肾间质纤维化的影响及机制，为NCTD用于肾脏病的治疗提供实验依据。方法：1、所有SD大鼠均行单侧肾切除术。实验组大鼠予以腹腔注射牛血清白蛋白(BSA)，建立蛋白超负荷肾病模型后随机分为模型组(BSA组，腹腔注射BSA 5g／(kg·d))、NCTD组(腹腔注射BSA 5g／(kg·d)和NCTD 0.1mg／(kg·d))和甲基强的松龙组(MP组，腹腔注射BSA 5g／(kg·d)和MP 1mg／(kg·d))；对照组(Saline组)仅注射等量生理盐水。第9周末处死大鼠。检测血常规及生化指标，各时相尿蛋白定量；肾组织行光镜、免疫荧光及电镜检查。2、实验分组及处理同方法1。免疫组织化学法及Western blot法对肾组织CTGF的表达进行定位及半定量分析；RT-PCR法检测肾组织中CTGF mRNA的表达水平。3、实验分组及处理同方法1。免疫组织化学法对肾组织NF-κBp65的表达进行定位及半定量分析；RT-PCR法检测肾组织NF-κBp65 mRNA的表达水平。4、通过细胞毒性实验筛选出对HK-2细胞无明显损伤的NCTD适合浓度。将HK-2细胞随机分为5组：对照组(1640培基组)，白蛋白组(1640+白蛋白5g／L)，各浓度NCTD组(1640+白蛋白5g／L+NCTD 0.5，1，2.5mg／L)。在各组HK-2细胞中加入相应干预液孵育24h后，采用细胞增殖法(MTT法)检测NCTD对白蛋白刺激HK-2细胞增殖的影响；酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各组细胞上清中FN的蛋白含量；RT-PCR法半定量分析HK-2细胞中FN mRNA的表达。结果：1、(1)各组血常规及谷丙转氨酶(ALT)比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。BSA组与其余3组比较，球蛋白(Glo)升高，肌酐清除率(Ccr)、白蛋白／球蛋白(A／G)降低(P＜0.01或0.05)，而NCTD组和MP组上述生化指标均较BSA组改善，且差异均有统计学意义(P＜0.01或0.05)。BSA组CRP明显高于Saline组(P＜0.01)。与BSA组比较，NCTD组及MP组CRP水平明显降低(P＜0.01)。相关分析显示，CRP水平与尿蛋白定量呈正相关(r=0.65，P＜0.01)。(2)随着BSA注射时间的延长，各实验组尿蛋白均逐渐升高。第5周末MP组与BSA组尿蛋白差异无统计学意义(P＞0.05)，而NCTD组尿蛋白较BSA组显著下降(P＜0.01)。第9周末，BSA组尿蛋白仍明显高于Saline组(P＜0.01)，NCTD组和MP组尿蛋白较BSA组均降低(P＜0.05)。(3)BSA组肾小管局灶性萎缩，肾间质大量炎症细胞浸润，伴有灶状纤维化，病理半定量积分显示肾小球硬化(GS)指数、小管间质病理损伤(TIL)积分均高于Saline组(P＜0.01)；IgG(3+～4+)沉积于系膜区，电镜显示肾小球系膜区可见电子致密物沉积，足突融合。NCTD干预后，肾组织上述病理形态学改变有所改善，且该组GS指数和TIL积分均较BSA组降低(P＜0.05)。MP组上述病理积分与BSA组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。2、(1)肾组织免疫组化及Western blot检测结果提示，NCTD组及MP组的CTGF蛋白表达较BSA组均下调(P＜0.01或0.05)。(2)NCTD组和MP组CTGF mRNA的表达较BSA组均减弱(P＜0.01)。3、(1)与BSA组比较，NCTD组和MP组NF-κBp65表达分布的阳性面积和阳性细胞数均明显降低(P＜0.01或0.05)。(2)NCTD和MP均可下调蛋白超负荷肾病大鼠肾组织NF-κBp65 mRNA的表达(P＜0.01)，且MP组NF-κBp65 mRNA的表达水平较NCTD组更低(P＜0.01)。4、(1)比较对照组及NCTD(0.5，1.0，2.5 mg／L)各组的乳酸脱氢酶(LDH)浓度，各组间的差异无统计学意义(P＞0.05)。(2)白蛋白组MTT值(0.438±0.073)明显高于对照组(0.330±0.060)(P＜0.05)，而NCTD(2.5 mg／L)组MTT值(0.327±0.080)较白蛋白组明显降低(P＜0.05)。(3)与白蛋白组比较，NCTD(2.5mg／L)组HK-2细胞上清中FN蛋白含量明显降低(P＜0.01)，NCTD(1mg／L和2.5mg／L)组细胞上清中FN mRNA的表达明显下调(P＜0.01)。结论：1、一定浓度去甲斑蝥素可降低蛋白超负荷肾病大鼠的尿蛋白，改善肾小管间质病理损伤程度，且无明显肝肾毒性及骨髓抑制等严重不良反应。2、去甲斑蝥素可通过下调蛋白超负荷肾病大鼠CTGF和NF-κBp65的表达水平，延缓肾间质纤维化。3、白蛋白(5g／L)诱导HK-2细胞增殖及FN过表达，一定浓度去甲斑蝥素可抑制白蛋白对HK-2细胞的活化作用。