背景:糖尿病肾病(DN)发病率逐年增高,发病机制复杂,病情进展则发生肾纤维化,治疗十分困难。目前对引起肾纤维化的信号通路及分子机制尚不完全清楚。PTEN基因编码的蛋白具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性,是PI3K/AKT和FAK通路的重要负调节因子。可通过负调节PI3K/AKT通路发挥抗纤维化效应。研究表明,在DN发病过程中,PTEN蛋白表达降低,PI3K/AKT通路激活而发挥多重致纤维化效应,但是影响PTEN表达的调控因素尚不甚清楚,有研究提示PPARγ可能从转录水平参与对PTEN的调控;而且,PTEN蛋白表达降低在DN发病中的具体作用机制,尤其是蛋白磷酸酶活性降低对DN肾纤维化的影响均有待阐明。因此,本研究拟通过对糖尿病肾组织PPARγ表达水平的干预,研究其对PTEN的调控及对肾纤维化的影响,同时,通过上调和下调PTEN表达观察对高糖条件下肾小管上皮细胞表型及纤维化病变的影响。以期进一步阐明DN肾纤维化的发病机制,为防治DN探寻新的有效靶点。第一部分糖尿病肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞PPARγ、PTEN表达的变化及其与肾组织纤维化的关系目的:探讨在高糖培养的肾小管上皮细胞及糖尿病肾组织中PPARγ、PTEN的表达变化及其与EMT和肾纤维化之间的关系。方法:(1)以NRK-52E细胞为研究对象,分为正常糖、高糖、高渗透压三组培养,Western blot及qPCR检测高糖及渗透压对PPARγ、PTEN蛋白及mRNA表达的影响。设0h、24h、48h及72h观察组,应用Western blot观察高糖对PPARγ、PTEN蛋白表达影响的时间依赖性。(2)NRK-52E细胞分别在正常糖、高糖条件下培养48小时,应用免疫荧光、Western blot和qPCR检测PPARγ、PTEN蛋白及mRNA表达变化,检测E-cadherin、Vimentin与α-SMA的蛋白表达变化。(3)以C57BL小鼠为研究对象,设立正常对照组及糖尿病模型组,检测两组小鼠血糖及肾功能水平,并观察小鼠肾组织病理变化。检测两组肾组织PPARγ、PTEN蛋白及mRNA表达变化,检测E-cadherin、α-sma与collagenⅢ的蛋白表达变化。结果:(1)体外高糖培养的肾小管上皮细胞中pparγ和pten的蛋白及mrna表达水平较正常组明显降低,差异有统计学意义(p<0.05),但高渗组与正常组无明显差异;在高糖条件下,pparγ和pten的表达随着时间的延长而逐渐降低,呈时间依赖性。(2)e-cadherin蛋白在正常糖组表达较多,高糖培养48h后e-cadherin蛋白水平较正常糖组显著下调(p<0.05),高糖组比正常组vimentin、α-sma蛋白表达显著增多(p<0.05)。(3)糖尿病小鼠血糖水平明显高于正常对照小鼠,两组差异有统计学意义(p<0.01);且在糖尿病组小鼠,crea及urea较正常组明显升高,差异有统计学意义(p<0.05)。正常对照组小鼠肾小球及肾小管形态正常,而糖尿病组小鼠肾组织肾小球、肾小管及肾间质均出现明显病变。(4)糖尿病小鼠pparγ、pten蛋白和mrna,以及e-cadherin的表达水平较正常对照组明显降低(p<0.05);而α-sma、collagenⅢ在糖尿病组表达较正常组明显增加(p<0.05)。结论:高糖培养的肾小管上皮细胞及糖尿病肾组织中pparγ、pten的表达较正常情况下明显降低,同时肾小管上皮细胞发生明显的的emt及纤维化病变。第二部分糖尿病肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞pparγ对pten表达的调控作用研究目的:探讨在糖尿病肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞中pparγ对pten的调节作用及其对emt和纤维化的影响。方法:(1)以高糖培养的nrk-52e细胞为研究对象,分别给予pparγ激动剂罗格列酮及抑制剂gw9662干预,分别设正常糖组(ng)、正常糖+罗格列酮组(nr)、正常糖+gw9662组(nt)、高糖组(hg)、高糖+罗格列酮组(hr)、高糖+gw9662组(ht),应用westernblot和qpcr检测各组pparγ、pten及emt相关指标的表达变化。(2)分别给予过表达pparγ及敲低pparγ基因后,应用免疫荧光、westernblot和qpcr检测各组pparγ、pten及emt相关指标的表达变化。(3)以c57bl的野生型小鼠及条件性肾小管上皮细胞pparγ基因敲除鼠为研究对象,分别设正常野生型组、正常基因敲除组、糖尿病野生型组、糖尿病基因敲除组,检测各组小鼠血糖及肾功能水平,光镜及电镜观察小鼠肾组织病理变化;免疫荧光、westernblot和qpcr检测两组肾组织pparγ、pten蛋白及mrna表达变化,检测e-cadherin、α-sma与collagenⅢ的蛋白表达变化。结果:(1)hg组与ng组相比,pparγmrna表达明显下降、pten蛋白及mrna表达明显降低,e-cadherin蛋白表达也下降,而vimentin和α-sma蛋白表达明显增高(p<0.05);hr组与hg组相比,pten蛋白及mrna表达有明显增多,e-cadherin蛋白表达也显著增高,vimentin和α-sma蛋白表达有所下降(p<0.05),而pparγmrna无明显变化;nr组与ng组相比pparγmrna表达无明显差异,而pten表达有增多趋势,但差异无统计学意义;ht组与hg组相比,pten、e-cadherin表达进一步降低(p<0.05),vimentin和α-sma蛋白表达进一步升高(p<0.05),而pparγmrna无明显变化。(2)过表达pparγ后,pparγ的mrna及蛋白表达增加,pten的mrna及蛋白表达也随之增高,e-cadherin的表达明显上调,而vimentin和α-sma蛋白表达显著下调,差异有统计学意义(p<0.05)。pparγ敲低组的pparγ及pten蛋白及mrna表达水平明显低于空载对照组,e-cadherin的表达也明显下调,而vimentin和α-sma蛋白表达显著升高,差异有统计学意义(p<0.05)。(3)糖尿病两组小鼠血糖水平明显高于非糖尿病两组小鼠,差异有统计学意义(p<0.01);糖尿病小鼠crea及urea较正常两组明显升高,差异有统计学意义(p<0.05),光镜及电镜检查显示正常糖两组小鼠肾组织无明显病变;糖尿病野生型小鼠肾小球及肾小管均显示出明显病变,在糖尿病基因敲除小鼠上述病变更加严重。(4)正常野生型小鼠肾组织pparγ、pten的表达较多,糖尿病野生型小鼠及正常基因敲除小鼠肾组织pparγ、pten表达水平显著降低,糖尿病基因敲除组小鼠表达水平最低(p<0.05)。糖尿病两组小鼠e-cadherin表达明显降低,糖尿病基因敲除组降低最为显著;与之相反,α-sma及collagenⅢ在正常组小鼠极少表达,在糖尿病组表达较正常组明显增加,糖尿病基因敲除组增加最为明显(p<0.05)。结论:(1)给予pparγ激动剂罗格列酮或过表达pparγ能增加细胞pten的表达水平,改善肾小管上皮细胞的emt及改善组织纤维化。(2)给予pparγ的抑制剂gw9662或敲低pparγ会降低细胞pten的表达水平,并加重细胞的emt及加重纤维化。(3)在小鼠体内敲除pparγ基因后,可以使pten表达水平降低,肾组织纤维化程度加重。第三部分糖尿病肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞pten对akt及fak的调控机制及其对emt的影响目的:探讨在体内及体外条件下,pten通过其脂质磷酸酶及蛋白磷酸酶活性调控akt及fak通路的机制,以及对糖尿病肾组织及高糖培养的肾小管上皮细胞emt和组织纤维化的影响。方法:(1)以c57bl的野生型小鼠及条件性pparγ基因敲除鼠为研究对象,分别设正常野生型组、正常基因敲除组、糖尿病野生型组、糖尿病基因敲除组,用免疫组化及westernblot检测各组肾组织pten的表达水平及其akt、p-akt、fak、p-fak表达变化。(2)高糖培养的nrk52e细胞,分别设对照组、空载组、野生型pten过表达组(gfp-pten)、129位突变组(gfp-pten-g129e)及敲低pten组(pten-shrna),应用westernblot和qpcr检测各组细胞akt及fak通路蛋白及mrna表达变化,并检测emt指标变化,划痕实验检测细胞迁移能力。(3)高糖培养的nrk52e细胞,设对照组、gw9662组、gw9662+过表达pten组、罗格列酮组、罗格列酮+ptenshrna组,westernblot检测各组细胞akt及fak通路蛋白表达变化。结果:(1)在糖尿病两组小鼠pten表达较无糖尿病组明显降低,糖尿病基因敲除组降低最为显著;而与之相反,p-akt、fak、p-fak在正常野生型组小鼠表达较少,正常糖基因敲除组表达也较少,在糖尿病组表达较正常组明显增加,糖尿病基因敲除组增加最为明显(p<0.05),而akt的表达水平在各组间无显著差异。(2)gfp-pten组及gfp-pten-g129e组,pten蛋白及mrna表达明显增多,显著多于对照组及空载组(p<0.05);在gfp-pten组,p-akt、fak、p-fak蛋白明显减少,显著少于对照组及空载组,fakmrna也显著减少(p<0.05);而在gfp-pten-g129e组,p-fak表达与gfp-pten组相当,均明显低于对照及空载组,而p-akt、fak表达较gfp-pten组增多,与对照组及空载组无明显差异,akt及fakmrna无明显变化;akt蛋白在四组中的变化无明显差异;e-cadherin在gfp-pten组明显升高,在gfp-pten-g129e组有所降低(p<0.05);vimentin及α-sma蛋白表达水平在gfp-pten组明显降低,而在gfp-pten-g129e组有所升高(p<0.05),与e-cadherin表达趋势相反;在gfp-pten和gfp-pten-g129e两组细胞迁移能力明显降低。转染pten-shrna后,pten的蛋白及mrna表达较对照组及空载组显著减少,p-akt、fak、p-fak表达明显增加,fakmrna表达增加,e-cadherin明显降低,vimentin及α-sma蛋白表达明显升高(p<0.05);pten敲低组细胞迁移能力明显增强,而akt蛋白及mrna无明显变化。(3)与对照组相比,gw9662组pten表达减少,而p-akt、fak及p-fak表达明显增多,差异有统计学意义(p<0.05);gw9662+过表达pten组与gw9662组相比,pten表达明显增加,并伴随p-akt、fak及p-fak表达减少,差异有统计学意义(p<0.05);而akt在各组间表达无明显差异。与对照组相比,罗格列酮组pten表达增多,而p-akt、fak、p-fak表达减少,差异有统计学意义(p<0.05);罗格列酮+ptenshrna组与罗格列酮组相比,pten表达减少,相应的p-akt、fak、p-fak表达增多,差异有统计学意义(p<0.05);akt在各组间表达无明显差异。结论:(1)pten可以通过调控akt及fak通路影响细胞emt及组织纤维化。(2)pten具有脂质磷酸酶及蛋白磷酸酶双重活性,其脂质磷酸酶活性可以调节akt及fak的磷酸化,同时也调节总fak的表达水平;其蛋白磷酸酶活性仅能调节fak的磷酸化水平,对总fak的表达无影响。(3)pparγ对akt及fak通路的调节主要是通过pten来实现的。第四部分糖尿病肾病患者肾组织pparγ、pten及akt、fak信号通路的表达水平与肾小管间质纤维化和肾功能的相关性目的:探讨在糖尿病肾病患者肾组织中pparγ、pten与akt、fak通路的表达变化及其与肾脏纤维化和肾功能状态的相关性。方法:以糖尿病肾病患者肾组织及正常肾组织为研究对象,设糖尿病肾病组及正常对照组,观察各组肾组织病理变化。应用免疫组化方法检测两组肾组织pparγ、pten、p-akt、p-fak及e-cadherin、α-sma与collagen-Ⅲ表达表达变化。生化分析仪检测两组患者肾功能及相关生化指标的变化,并将肾功能状态与上述指标做相关性分析。结果:(1)正常组肾组织肾小球及肾小管形态正常。糖尿病肾病患者肾小球毛细血管基底膜增厚,系膜基质增生,部分形成结节状硬化;肾小管管腔扩张,上皮细胞肿胀及空泡变性,基底膜不规则增厚,肾间质可见较多细胞外基质沉积,有较多炎症细胞浸润。(2)正常肾组织,pparγ、pten及e-cadherin的表达较多,p-akt、p-fak、α-sma及collagenⅢ表达较少,糖尿病患者肾组织pparγ、pten及e-cadherin蛋白表达水平较正常对照组明显降低,p-akt、p-fak、α-sma及collagenⅢ表达明显增加(p<0.05)。(3)两组患者的年龄、性别构成、体重指数及吸烟比例无显著差异;糖尿病肾病组患者bg、crea、urea及24小时尿蛋白水平均明显高于正常对照组,估算的肾小球滤过率显著低于正常对照组(p<0.05);以估算的肾小球滤过率(egfr)为反应肾脏损伤程度的标准,分析了egfr与上述指标表达的关系。结果显示,患者的eGFR与PPARγ(r=0.588,P<0.05)、PTEN(r=0.791,P<0.05)呈显著正相关,与p-AKT(r=-0.572,P<0.05)、p-FAK(r=-0.478,,P<0.05)呈负相关。结论:(1)在糖尿病肾病患者肾组织中PPARγ和PTEN的表达明显减少,而p-AKT及p-FAK显著增加,且这种改变是与TIF的加重和肾功能的恶化相伴随的。(2)PPARγ及PTEN可以一定程度作为糖尿病肾病肾脏损伤的标志物及治疗的靶点。