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哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性、发光的海洋细菌,在海洋环境中分布广泛。哈维氏弧菌是海水养殖动物的重要致病菌,近年来给海水养殖业造成了巨大的经济损失,因此建立灵敏、准确、快速的检测技术成为研究的重要方向和生产发展的急需,本研究拟建立哈维氏弧菌的快速检测技术。另外,目前已知哈维氏弧菌的致病性可能与其胞外产物中的溶血素、蛋白酶(包括丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶)、磷脂酶和脂酶等相关,至于是否还有其它毒力因子,尚不十分清楚。本文拟对toxS,tcpA, zot, flaB和flaC五种其他弧菌中的重要毒力基因在哈维氏弧菌中的分布进行筛查。toxR(toxin regulator)基因是在弧菌中广泛分布的毒力基因的表达调控基因,能对多种弧菌毒力基因的表达进行调控,而且不同弧菌的toxR序列同源性较低。本文根据哈维氏弧菌toxR基因片段(AY247418),设计特异性引物,对56株弧菌进行PCR检测,发现20株哈维氏弧菌(包括两株标准菌株)均可以扩增出382 bp的片段,检出率为100%,并对从养殖场发病鱼中分离的21株菌株进行检测,检测出哈维氏弧菌9株,检出率为42.85%,其菌株号分别为XVP5、TA-1、FA-1、FM-1、C-12D、R2-16K、CY-16D、CC-36D和Vang。从这些所检测的阳性结果中,任意选取两株(XVP5和FA-1)进行16SrRNA测序,将测序结果与GenBank中已发表的弧菌标准菌株的16SrRNA进行比对,用DNASTAR软件建立系统进化树,结果证明这两株菌为哈维氏弧菌。从DNA提取到PCR产物鉴定结束整个检测过程,所用时间不到5个小时,检测的菌样最低浓度4.0×103 cfu.ml-1。由此建立了一种快速、特异、灵敏度较高的检测哈维氏弧菌的方法。而哈维氏弧菌的toxR基因是否对毒力基因有调控作用,目前还不清楚。此前仅知道哈维氏弧菌toxR基因的部分序列,本文将克隆toxR基因全长,为进一步研究该基因的功能打下基础。toxR对霍乱弧菌和副溶血弧菌的毒力基因表达起重要作用,并能促进创伤弧菌溶血素基因的表达,且对其外膜蛋白OMP(outer membrane proteins)表达起调控作用。在鳗弧菌中,只发现其可以调控OMP的表达,但未发现其对毒力基因的调控作用。哈维氏弧菌的toxR基因是否对毒力基因有调控作用,目前还不清楚。此前仅知道哈维氏弧菌toxR基因的部分序列,因此克隆toxR基因的全长,成为下一步研究的首要条件。本文利用LAPCR试剂盒,设计内外两对引物,根据试剂盒的操作步骤,通过连续两次PCR,成功地克隆了哈维氏弧菌toxR基因的部分未知序列,并进行了序列测定。toxS,tcpA, zot, flaB和flaC是霍乱弧菌和副溶血弧菌的重要毒力基因。本文根据GenBank提供的序列设计引物,通过PCR检测它们在哈维氏弧菌中的分布情况。结果显示,toxS基因在25株弧菌标准菌株(2株哈维氏弧菌的结果为阴性)中,有8株PCR扩增获得特异性片段,其它哈维氏弧菌中有4株结果为阳性。zot基因在25株弧菌标准菌株(2株哈维氏弧菌的结果为阴性)中有2株获得目的片段,其它哈维氏弧菌结果为阴性。tcpA在25株弧菌标准菌株(2株哈维氏弧菌的结果为阴性)中有4株结果为阳性,其它哈维氏弧菌结果为阴性。flaB在25株弧菌标准菌株(2株哈维氏弧菌的结果为阳性)有11株结果为阳性,其它哈维氏弧菌28株结果为阳性。flaC在25株弧菌标准菌株中(2株哈维氏弧菌的结果为阴性)有13株结果为阳性,其它哈维氏弧菌中12株结果为阳性。将不同的哈维氏弧菌菌株注射斑马鱼,对这五种基因与哈维氏弧菌的致病性的关系作了研究,结果显示这五种基因的分布与哈维氏弧菌致病性没有明显的相关性。