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B-box蛋白(BBX)含有一个或两个保守的B-box特征结构域,属于锌指蛋白转录因子超级家族,普遍存在于动植物中。植物BBX蛋白参与幼苗的光形态建成、开花、光周期调控及避荫反应等,近年来拟南芥的一个BBX(At BBX5)被发现与植物抗逆有关,本实验室也在前期苹果胁迫转录组中发现一个盐胁迫明显诱导上调的BBX成员。本研究从苹果基因组中鉴定出所有的BBX家族成员(MdBBX),对各基因的染色体定位、启动子区域以及胁迫响应等进行了系统的分析;通过片段缺失和定点突变技术,研究了MdBBX的功能区域和关键氨基酸位点;利用拟南芥超表达MdBBX,进一步探究在植物体内MdBBX对非生物胁迫的抗逆机制。主要研究结果如下:(1)从苹果基因组中鉴定得到64个BBX编码基因。采用本地BLAST和隐马尔可夫统计模型两种方法在苹果全基因组中查找潜在的BBX编码基因,将得到的候选序列提交到SMART和Interpro两个数据库,分别检验是否包含B-box特征编码序列,最终在苹果基因组中鉴定出64个BBX编码基因,分别命名为MdBBX1-64。苹果中BBX成员数量明显多于其他植物,约是其他植物物种的2倍,有些MdBBX基因的碱基序列相似度高,分析表明MdBBX基因的扩增是苹果染色体串联重复和片段重复导致的。(2)MdBBX蛋白的系统进化分析及B-box保守氨基酸特征分析。苹果64个Md BBX成员从亲缘关系上可分成5组,I组和II组成员在氨基端有两个紧密相连的B-box结构域,III组成员只有一个B-box结构域,I、II和III组成员均在羧基端有一个额外的结构域(CCT结构域),而IV和V组的大部分成员没有CCT结构域,IV成员有两个相连的B-box结构域,V组只有一个B-box结构域。将MdBBXs的氨基酸序列提交到MEME网站分析,得到了B-Box1和B-Box2的特征氨基酸序列logo,两个B-box结构域的氨基酸序列有较高的相似度,有5个保守的半胱氨酸(Cys)残基,其中4个Cys位于Cys-X-X-Cys框架中,分析表明,这些Cys与锌指蛋白中锌离子形成锌指结构有关。(3)MdBBXs启动子区响应元件及响应胁迫分析。共有48个MdBBXs基因的上游序列(约1.5 kb,被认为是启动子序列)在苹果基因组中被找到,将这些启动子序列提交到PlantCARE数据库进行分析,至少32个MdBBXs的启动子区域都存在胁迫响应元件或与胁迫密切相关的MYB转录因子的结合元件,比如HSE、TC-rich repeats和ARE等。对1年生的苹果苗进行不同胁迫处理,随机选取12个MdBBXs探究胁迫下基因表达的变化。PEG模拟渗透处理后,全部12个MdBBXs在叶片和根系中都表达上调,有4个基因上调倍数高,在40-65倍之间。对于盐和冷处理(4℃),近一半的MdBBXs上调表达较明显,如MdBBX19和MdBBX62在根中分别上调了20倍,有些MdBBXs变化不大。外源ABA处理后,部分MdBBXs表达上调,其中MdBBX40在叶中上调达25倍,这些结果表明大多数MdBBXs受胁迫诱导表达上调。(4)重组表达MdBBX10提高了大肠杆菌细胞的抗盐及抗渗透能力。前期转录组研究发现MdBBX10在盐胁迫下明显上调表达。Md BBX10由186个氨基酸组成,仅包含一个B-box结构域,无其他特征结构域。利用大肠杆菌重组表达MdBBX10,以转化空质粒为对照。在含有NaCl、KCl或甘露醇的固体胁迫培养基上,表达MdBBX10的大肠杆菌的菌落数明显多于对照;液体培养下,MdBBX10的表达也明显提高了细胞对胁迫的忍耐力,生长速度明显快于对照;缺失B-box结构域后,MdBBX10丧失抗逆能力;突变保守的Cys残基突变后,MdBBX10的抗逆能力也明显下降,而非保守位点的Cys残基的突变,未明显影响MdBBX10的抗胁迫能力。这说明MdBBX的B-box结构域与提高原核细胞耐盐与渗透胁迫能力有关,且保守Cys起关键作用。(5)MdBBX10在植物中的表达模式分析。克隆MdBBX10基因上游1.5 kb序列,将之构建到表达质粒中作为报告基因GUS的启动子,转化拟南芥并得到纯合体株系。GUS染色表明,MdBBX10在生长速度较快的部位中表达,如根尖、生长点、花托基部、花药及发育的种子。亚细胞定位发现该基因定位于细胞质和细胞核中。对3周苗龄的幼苗进行胁迫处理,通过GUS染色观察其表达量的变化,在胁迫处理下,GUS的表达明显提高,说明MdBBX10的表达受胁迫诱导,暗示这个基因可能参与胁迫响应。(6)拟南芥中超表达MdBBX10提高了植株对胁迫的耐受性。通过花序浸染法得到超表达MdBBX10的拟南芥纯合株系。在正常生长状态下,超表达株系(OE)与野生型(WT)在表型上无明显差别,而胁迫下,OE与WT有明显差别。在分别含有NaCl和甘露醇的培养基进行种子萌发时,OE株系的萌发率明显高于WT;根长也比WT的长;用NaCl处理30天苗龄的拟南芥,OE的存活率明显高于WT;胁迫处理后OE株系中ABA合成相关基因(ABA1、ABA2)的表达高于WT,OE中活性氧(ROS)清除酶类基因(SOD、POD等)的表达量明显高于WT,而ROS的含量低于WT,说明超表达MdBBX10后,拟南芥抗逆能力的提高与ROS清除有关,暗示MdBBX10可能是通过ABA信号参与胁迫响应的。