论文部分内容阅读
黄瓜(Cucumis sativus)是我国重要的设施蔬菜作物之一,其营养价值丰富,经济价值较高,在丰富居民菜篮子、满足蔬菜周年供应、农村致富及农民增收中起着重要作用。但是近年来随着耕作模式的调整及环境的变化黄瓜上的病毒病呈现多发常发态势,给黄瓜作物安全生产造成了严重的困扰。瓜类褪绿黄化病毒(Cucurbit chlorotic yellows virus,CCYV)是一种侵染危害多种瓜类作物的粉虱传植物病毒,该病毒自2010年传入我国以来,给多个省市的甜瓜、西瓜、黄瓜等作物生产造成了严重的损失。2016年,我们在对山东寿光等地黄瓜上病毒病进行调查时发现当地黄瓜上出现一种叶片表现黄化植株伴有轻微矮缩的病害,为明确其中伴随的病毒种类,我们对田间采集病样进行了分子检测,结果从中检测到了瓜类褪绿黄化病毒,进一步的CP基因克隆及序列分析也证实了这一结果,这是该病毒在山东侵染黄瓜的首次报道,山东一方面是我国重要的蔬菜生产基地,CCYV的发生可能会给当地黄瓜生产造成严重的威胁,另一方面山东亦是全国重要的种苗基地,全国范围的种苗调运极有可能进一步加剧CCYV在更大范围的扩散蔓延,因此该病害在黄瓜上的危害值得密切关注。为进一步明确该分离物的特征及分类地位,为后续研究该病毒致病机理奠定基础。本研究通过分段法对CCYV的基因组进行了克隆,序列测定后拼接获得CCYV山东分离物基因组(RNA1和RNA2)序列信息。序列分析结果显示其基因组RNA1全长8,607 bp,RNA2全长8,041 bp,共编码12个蛋白;序列同源性比对分析结果显示其与已报道的CCYV其它分离物高度同源,同源性超过99.5%;聚类分析结果也显示它们共同聚类到CCYV分支中,这些结果说明山东黄瓜上分离的病毒为瓜类褪绿黄化病毒,这也是山东省黄瓜作物上瓜类褪绿黄化病毒基因组序列的首次报道。很多研究结果显示病毒编码蛋白的亚细胞定位是其行使功能的基础和场所,因此研究病毒编码蛋白的亚细胞定位有益于推进病毒编码蛋白功能的解析。而目前在CCYV上编码蛋白的亚细胞定位研究报道还较少,为明确其编码蛋白的亚细胞分布,我们对其编码的9个蛋白进行克隆并构建带有YFP荧光标签的表达载体,浸润本氏烟叶片后利用激光共聚焦显微镜进行观察,结果发现在9个蛋白中P6-1、P4.9、P9、CP、CPm在细胞能正常转录表达(Western blot),这些蛋白在细胞质和细胞核均有分布,其中CPm在核仁有富集;而剩余的P22、P26(表达微弱)、P6-2、HSP70h等几个基因表达不好(Western blot未检测到),未对其定位进行研究。而目前在CCYV编码蛋白中,仅有P4.9有定位研究报道(与本研究一致)。这些工作为后续研究其在病毒侵染致病过程中的作用奠定了基础。CCYV虽然编码蛋白较多,但有功能报道的蛋白较少,为研究其编码蛋白在病毒致病过程中的作用,本研究对CCYV编码的10个基因(RNA1编码P6-1和P22,RNA2编码(CP、CPm、HSP70h、P59、P26、P9、P6-2、P4.9)进行克隆,并利用马铃薯X病毒(PVX)异源病毒载体对其致病特征进行了研究,结果发现有8个基因在浸润接种的本氏烟上会引起更严重的症状:P6-1诱导新叶出现明显黄化、皱缩和坏死;P22诱导出现系统性坏死;P4.9诱导上部叶片皱缩、有坏死斑点;P6-2诱导上部叶片出现皱缩、伴有坏死斑点;P59诱导新叶变小、皱缩并伴有坏死斑点;CP诱导系统叶出现皱缩并伴有坏死斑点;CPm诱导上部叶片严重褪绿黄化;P26诱导植株上部叶片褪绿、花叶;而接种PVX的对照组植株仅表现轻微的花叶症状,暗示了这些基因可能参与了病毒侵染及致病等相关进程。而另外两个基因(HSP70h、P9)在本氏烟上引起的症状与对照组相近,推测其可能不直接作为致病因子参与症状形成。为进一步解析CCYV编码的致病相关候选因子的作用方式,本研究利用酵母双杂交系统对前期筛选获得的8个候选因子与病毒编码其它蛋白的互作关系进行了研究,结果发现在筛选的110个组合中,P22、P59、P6-2之间存在互作,而三者在异源过量表达时都会引起坏死,三者互作可能有利于相互调控,抑制其在病毒侵染时产生的坏死反应;同时P6-2及P59与HSP70h之间也发现存在互作,暗示了HSP70h可能参与抑制其产生的坏死反应;P59自身存在互作,暗示了其可能存在多聚蛋白参与病毒与寄主的互作。综上所述:本研究从山东黄瓜上分离了CCYV,并以此作为研究对象,对其全基因组进行了克隆和序列测定,明确了其基因组结构特征,同时利用共聚焦观察研究了编码蛋白的亚细胞定位特征,借助异源病毒表达系统研究了其编码蛋白的致病特征,明确了8个编码蛋白会加重病害症状,是致病相关候选因子,并利用酵母双杂交技术筛选了与其互作的病毒编码蛋白,初步探讨了其在病毒侵染致病过程中可能的作用方式,为后续深入解析CCYV编码蛋白在致病过程中的作用机理奠定了基础,同时也为后续有针对性的制定靶向病毒致病关键进程的病毒防控策略提供了借鉴。