论文部分内容阅读
星星草（Puccinellia tenuiflora）广泛分布于松嫩平原的盐碱地,是一种耐盐碱能力很强的多年生禾本科植物。本试验的目的是通过抑制消减杂交技术结合cDNA微阵列技术分离盐碱诱导基因及与耐盐碱相关基因群。试验材料采用2004年5月份返碱期在黑龙江省青冈县天然盐碱地（pH9.5）草场采集的星星草作为盐碱胁迫材料（tester）,同期日光温室培养土（pH5-6）条件下生长8周的星星草作为非盐碱胁迫材料（driver）。用上述两种材料制作成抑制消减文库。 本试验将抑制消减杂交第2次PCR的产物连接至pGEM-T载体中,随后转化到JM109感受态细胞,经蓝白斑筛选、培养后提取质粒DNA。应用测序试剂盒（Amersham）进行质粒DNA测序PCR反应,产物经纯化后在MegaBACE 500测序仪上测序。得出的序列经SeqClust2.1软件去除冗余,与NCBI数据库中序列进行比对得到部分基因的预测功能。 本试验共分离出2195条200bp以上的序列（平均长度391bp,最长片段1012bp）。通过去除冗余序列得到非重复序列1041条,经过SeqClust2.1软件拼接得到472条序列,这472条序列与GenBank数据具有同源性的有207条,占43.9%;没有显著同源性的有265条序列,占56.1%。在有同源性的序列中,功能已知的有103条,功能未知的104条。这些基因的功能包括活性氧清除、渗透调节、基因调控、离子转运等,并由此推测星星草耐盐碱过程可能与这些基因的表达及其代谢相关。 以“nest primer 1”和“nest primer 2R”为引物,通过PCR的方法将以上差库获得的1041个非重复插入基因片段从星星草SSH文库克隆中扩增出来用于制作芯片。添加8个酵母特有基因间核苷酸片段做外标。以上的核酸序列由北京博奥公司点制成芯片,每张芯片上的每个基因重复3次。在反转录过程中,分别用Cy3、Cy5荧光染料标记盐碱地和温室培养星星草的mRNA,按照3DNA Array900?试剂盒（Genisphere Inc.）的使用说明完成芯片杂交。用ScanArray 4000?芯片扫描仪扫描芯片,扫描时根据添加的外标调整Cy3与Cy5的信号强度,使信号均一化。扫描后通过SAM软件分析上述样品基因表达差异的显著性。设定域值△=0.427,我们得到185个显著上调的基因,其中与GenBank中助能已知序列有显著同源性的有42个,包含脱水素基因,过氧化氢酶,脱氢抗坏血酸酶,谷胱苷肽-S-转移酶,热激蛋白等已报道的与盐碱、干旱胁迫相关的基因:同时得到8个显著下调的基因,其中4个与GenBank中序列有显著同源性,但功能未知,另外4个与GenBank中序列没有显著同源性。