目的观察高糖对人脐静脉内皮细胞生物学性状的影响，探讨内皮间质转化（endothlial-mesenchymal transition，EndoMT）在糖尿病视网膜新生血管病变中的作用机制。方法1．细胞培养及实验分组使用含10％胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的高糖DMEM培养基培养人脐静脉内皮细胞株EA.hy926，在37℃，5％CO₂培养箱内传代培养。细胞达到90％融合时，传代于细胞培养板上，随机分为两组，进行相关实验。实验分组：对照组：加入含2％FBS高糖DMEM培养液，葡萄糖浓度为25mmol／L；高糖组：加入含2％FBS高糖DMEM培养液，添加葡萄糖使葡萄糖浓度达到50mmol／L。2．相差显微镜观察高糖对EA.hy926细胞形态的影响每日使用倒置相差显微镜直接观察细胞形态并照相。3．MTT检测高糖对EA.hy926细胞增殖的影响将100μl细胞混悬液（5×10³个／孔）接种到96孔板，细胞贴壁后，血清饥饿24h，分组，测定高糖在24h、48h、72h、96h对细胞增殖的抑制率。4．Transwell小室和划痕实验检测高糖对EA.hy926细胞迁移能力的影响（1） Transwell小室测定细胞迁移能力的变化将100μl细胞混悬液（10⁵个／孔）接种到transwell小室内，8h后结晶紫染色测定迁移到transwell小室聚碳酸酯膜下方的细胞数，并用10％乙酸抽提测其吸光度（A）值。（2）划痕法测定细胞迁移能力的变化细胞达到融合后，用100μl的枪头垂直划痕，宽度约500μm，分组，培养8h后计数迁移到划痕内的细胞数。5．免疫荧光检查将细胞接种到24孔板内的载玻片上，细胞90％融合后，分组，测定3天、7天和15天内皮细胞标志蛋白（血管内皮钙黏附素（VE-钙黏蛋白）和a-连环蛋白）、间质细胞标志蛋白（神经钙黏蛋白（N-钙黏蛋白）、波形蛋白、纤维连接蛋白和a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA））、血管内皮细胞生长因子（VEGF）和细胞转型调控因子Twist的表达变化。6．RT-PCR检查将细胞接种到24孔板内，细胞90％融合后，分组，测定3天、7天和15天EA.hy926细胞VE-钙黏蛋白、波形蛋白、N-钙黏蛋白、VEGF及细胞转型调控因子Twist的mRNA表达变化。结果1．高糖对EA.hy926细胞形态的影响随着培养时间的延长，高糖组细胞逐渐由铺路石样变为条梭形，细胞极性消失，对照组细胞形态基本上没有变化。2．高糖对EA.hy926细胞增殖能力的影响高糖抑制细胞的增殖，在细胞融合前，随着时间的增长，抑制率增加，各个时间点两组差异有统计学意义（P＜0.05）。3．高糖对EA.hy926细胞迁移能力的影响高糖组迁移到transwell小室聚碳酸酯膜下方的细胞数增多，乙酸抽提后测得的A值也高于对照组，高糖组迁移到划痕内的细胞数也增多，两组差异均有统计学意义（P＜0.05）。4．免疫荧光检查VE-钙黏蛋白：VE-钙粘蛋白正常表达于细胞与细胞连接处，随着时间的延长其表达量和分布变化不大。培养液中葡萄糖浓度增高后，3天时细胞与细胞连接处的VE-钙粘蛋白变化不大，7天时表达减少，15天时细胞连接处的VE-钙粘蛋白进一步减少，但是胞浆内VE-钙粘蛋白表达增多。N-钙黏蛋白：N-钙粘蛋白正常弥漫表达于细胞膜上，也与VE-钙粘蛋白共同表达于细胞与细胞连接处。3天时，高糖组N-钙粘蛋白表达低于对照组；7天时，高糖组N-钙粘蛋白表达高于对照组；15天时两组N-钙粘蛋白的表达基本一致。a-连环蛋白：a-连环蛋白正常表达于细胞与细胞连接处，随着时间的延长其表达量和分布变化不大。培养液中葡萄糖浓度增高后，随着时间的延长，细胞连接处的a-连环蛋白表达减少，细胞间缝隙增加。波形蛋白：波形蛋白是间质细胞的骨架蛋白，正常在内皮细胞有少量表达，随着时间的延长，表达量及分布变化不大。培养液中葡萄糖浓度增高后，3天时，与对照组比较，表达量及分布变化不大；7天时部分细胞波形蛋白表达增多；15天时大部分细胞波形蛋白表达增多，且波形蛋白浓缩聚集于近核膜处，有利于细胞迁移。细胞转型调控因子Twist：细胞转型调控因子Twist蛋白正常表达于细胞浆或细胞核内，3天和7天时，对照组中Twist的表达变化不大，15天时表达增加。高糖组，3天时与对照比较表达量变化不大，随着时间的延长，表达量明显增加，且高于对照组。纤维连接蛋白：对照组中，纤维连接蛋白随着时间的延长表达量轻度增加，葡萄糖的浓度增高后，随着时间的延长纤维连接蛋白的表达量增加，且在每个时间点表达量均高于对照组。VEGF：3天时高糖组VEGF的表达量低于对照组，随着时间的延长，对照组VEGF的表达量降低，7天和15天时表达量没有变化，高糖组随着时间的延长，VEGF的表达量增加，并且在7天和15天时均明显超过对照组。a-SMA：细胞分组培养15天之后，高糖组部分细胞表达a-SMA，对照组无a-SMA阳性表达的细胞。5．RT-PCR检查VE-钙黏蛋白：对照组中，3天和7天时VE-钙黏蛋白转录基本上变化不大，15天时转录轻度上调。增加葡萄糖的浓度后，3天时VE-钙黏蛋白的转录水平明显低于对照组，而7天时，VE-钙黏蛋白转录上调且高于对照组，15天时VE-钙黏蛋白转录水平变化不大，与对照组比较也无变化。N-钙黏蛋白：3天时，高糖组N-钙黏蛋白转录水平明显低于对照组，7天时，对照组转录下调，高糖组转录上调且明显高于对照组，15天时，对照组转录上调，高糖组基本无变化，两组N-钙黏蛋白的转录水平基本相同。VEGF：3天时，高糖组中VEGF的转录水平明显低于对照组，7天时，对照组转录下调，高糖组转录上调且明显高于对照组，15天时，对照组无变化，高糖组转录轻度下调但仍高于对照组。波形蛋白：随着时间的延长，波形蛋白基因转录水平轻度上调，在每个时间点，高糖组波形蛋白基因转录水平均高于对照组。Twist：3天时，对照组和高糖组Twist基因转录水平基本相同，7天时对照组变化不大，高糖组转录明显上调，15天时，高糖组变化不大而对照组转录上调，两组间基本相同。结论高糖可以破坏内皮细胞黏附连接，抑制细胞增殖，促进细胞迁移，使内皮细胞发生间质转化，这种变化在糖尿病视网膜新生血管和纤维膜形成中可能起着重要作用。