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实验目的：1．观察兔骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs）生长状况及生物学特性，建立兔骨髓间充质干细胞稳定的体外培养体系。2．研究三七总皂苷（Panax Notoginseng Saponin, PNS）对兔BMSCs增殖及成骨分化的影响。3．研究PNS对兔BMSCs的转化生长因子-β1（Transforming GrowthFactor-β1, TGF-β1）表达的影响及探讨成骨诱导的机制。研究方法：1．通过全骨髓培养法、密度梯度离心法从幼兔长骨骨髓中分离出BMSCs，进行纯化、扩增行细胞培养，通过观察细胞形态及生物学性状，确立较为稳定的培养体系。2．流式细胞术检测兔BMSCs表面抗原标志CD29、CD45及HLA-DR。采用四甲基偶氮唑盐（Methyl Thiazoly Terazolium, MTT）法绘制生长曲线筛选不同代数的兔BMSCs，根据增殖速度、细胞数量等确定最佳的实验细胞代数；分析不同浓度PNS干预兔BMSCs的生物活性影响，选择最适宜的用药浓度。3．用PNS含药培养基培养兔BMSCs后，对甲苯胺蓝染色法检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase, ALP）活性，茜素红染色法检测细胞钙结节含量，实时荧光定量PCR（Real time fluorescent quantitative PCR, qRT-PCR）法检测细胞因子TGF-β1的mRNA表达,蛋白质免疫印迹（Western blot, WB）法检测TGF-β1的蛋白质表达。实验结果：1．密度梯度离心法及全骨髓培养法均可成功分离培养兔BMSCs，前者原代细胞更纯，原代兔BMSCs种瓶24h可贴壁，10~14d细胞融合可达瓶底面积80%~90%，传代后细胞纯度、增殖速度增加，镜下观察可见典型兔BMSCs形态为贴壁长梭状成纤维样细胞。2．流式细胞术检测细胞表面CD29阳性率为97.4%，CD45和HLA-DR阳性率仅0.1%。MTT法提示三代细胞的细胞增殖活性相仿，PNS各浓度含药培养液与普通培养液对兔BMSCs的增殖能力、增殖速度之间不存在明显区别。3．碱性磷酸酶染色结果显示：用药组比阴性组ALP活性更高（P＜0.05），而100mg/L、200mg/L两用药组之间无明显差异。茜素红染色结果可见，PNS各浓度组中有不同程度的阳性表达，成骨诱导液组为强阳性表达，钙结节计数中发现100mg/L PNS组在各浓度用药组中的钙结节含量最多（P＜0.05）。qRT-PCR法结果表示，与阴性组相比，100mg/L PNS组对TGF-β1mRNA表达量有明显的上调作用（P＜0.05）。Western blot结果发现，PNS用药组比阴性组的TGF-β1蛋白表达含量高，其中最高的为100mg/L组（P＜0.05）。结论：1．密度梯度离心法及全骨髓培养法均可获得稳定性、均一性良好的兔BMSCs，其中密度梯度离心法分离细胞更纯，效果较优。2．PNS可促进兔BMSCs的成骨分化作用，其诱导成骨最佳作用浓度为100mg/L。但PNS对兔BMSCs增殖作用影响不大。3．PNS可促进兔BMSCs的TGF-β1的分泌，可能与引起BMSCs成骨诱导机制相关。