近些年来，随着光学仪器和检测技术的不断发展，荧光技术由于具有灵敏度高，选择性好，简单实用，指标参数丰富，生物毒性小等优点，被广泛应用于分析化学、生物化学及细胞生物学等生命科学研究领域。而在此基础上发展出的荧光探针(Fluorescent probe)更是成为生命科学检测中常用的分析方法。和其它检测手段相比，荧光探针具有特异性好，灵敏度高，时间和空间分辨率高，响应迅速，成本低廉等优点，在生物体内微量或痕量物质的检测，生理活动的可视化追踪，疾病的诊断与治疗等方面发挥着举足轻重的作用。　　吡咯并吡咯二酮、吩嗪和氮杂苝等氮杂芳烃荧光团均为具有出色稳定性和光物理性能，具有发展成高性能有机荧光团的潜能。本文以这三种氮杂芳烃荧光团为骨架，通过对其分子结构的修饰改善其溶解性以及吸收和荧光发射光谱，设计合成了一系列具有不同识别功能的比率型近红外荧光探针，对生物体中存在的多种常见功能性生物小分子（硫醇、硫化氢以及次氯酸）实现高灵敏度、高选择性检测，并在细胞（包括线粒体、溶酶体等细胞器）、血清、生活用水等实际应用环境中实现了这些生物小分子的定性或定量检测。　　第一章对荧光探针的结构特点、响应机理和设计原则进行了概述。简单介绍了小分子生物硫醇（半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽），硫化氢和次氯酸等功能性生物小分子的结构特点和理化性质，并按照反应类型的不同，对近期用于这些功能性生物小分子检测的荧光探针进行了综述。并在此基础上提出了本论文的设计思路和主要研究内容。　　第二章小分子生物硫醇（Cys、Hcy以及GSH）在维持生物体内环境稳态方面起着非常重要的作用，实现对内源性生物硫醇的选择性检测对于实验研究以及临床治疗具有重大意义。本章设计合成了以吡咯并吡咯二酮(DPP)为荧光团，丙烯酰基为检测基团的比率型近红外荧光探针DPP-AC，并通过核磁共振氢谱、碳谱以及高分辨质谱对其结构进行了表征。在对Cys的响应测试中，DPP-AC对Cys表现出比率型荧光响应。随着Cys的加入，DPP-AC在664nm附近的近红外荧光发射不断下降，而552nm附近的黄色荧光不断增强，荧光强度比率信号(I552nm/I664nm)与Cys的浓度(0-100μM)呈现非常好的线性关系，计算得到的检测限为84nM，具有对低浓度Cys进行定量检测的能力。此外，DPP-AC不仅可以实现对生物硫醇的选择性检测，还对三种小分子生物硫醇(Cys，Hcy和GSH)具有很好的区分能力。这主要是由于丙烯酰基与Cys之间发生Michael加成-分子成环反应后脱掉丙烯酰基并裸露出给电子能力更强的酚羟基，使探针体系的ICT过程减弱，吸收和荧光发射波长蓝移。由于DPP-AC良好的光稳定性和化学稳定性，因此，探针被成功应用于活细胞中内源性Cys的成像检测中，并能在细胞环境下通过细胞比率成像的方式对三种小分子生物硫醇进行选择性区分。DPP-AC是第一个以DPP为荧光团并能够选择性区分三种生物硫醇的比率型近红外荧光探针，为今后荧光探针的设计提供了新思路。　　第三章为了进一步提高生物硫醇荧光探针分子的水溶性，在保证优异稳定性和光物理特性的前提下，本章选择分子体系更小，共轭结构更小的吩嗪为荧光团，巴比妥酸为检测基团，设计合成了用于选择性检测半胱氨酸的比色/比率型近红外荧光探针PBA。由于强拉电子基团巴比妥酸的引入，连接吩嗪和巴比妥酸基团的C=C双键被活化，容易受到具有强亲核能力的半胱氨酸分子的进攻，造成分子内共轭体系被破坏，分子内电荷转移过程被切断，引起吸收和荧光发射峰的大幅度蓝移。在对Cys的响应测试中，PBA表现出优异比色/比率型光学响应。当吩嗪与巴比妥酸之间的C=C双键与Cys巯基发生反应后，PBA溶液在610nm附近的最大吸收峰和707nm荧光发射峰都逐渐下降，而588nm处的荧光大幅度增强，通过裸眼即可观察到溶液的颜色由绿色变为淡黄色，荧光也有红色变为黄色，说明吩嗪与巴比妥酸之间的ICT过程被打断，并且荧光比率信号(I588nm/I707nm)与Cys的浓度呈现很好的线性关系，检测限低至74nM。此外，PBA与Cys的反应可以在极短的时间内完成，表现出极高的灵敏度。更值得惊喜的是，PBA不仅可以对生物硫醇有出色的选择性，还可以通过反应速率和程度的不同，实现对三种生物硫醇的区分。此外，巴比妥酸的引入使得探针分子可以很好地吸附在TiO2表面，创新性地构建出了新型TiO2传感器件，通过器件膜吸收的变化，实现了对血清内高半胱氨酸含量的定量检测。　　第四章作为目前公认的第三类气体信号分子，硫化氢在生物体内发挥着十分重要的作用，尤其是线粒体或溶酶体等亚细胞结构中实现对硫化氢的选择性定量检测对于疾病的诊断和治疗是非常有帮助的。本章以具有优良光物理性质的氮杂苝为荧光团设计合成一系列用于选择性检测硫化氢的比色/比率型近红外荧光探针(NPNM，Mito-NPNM以及Lyso-NPNM)。在生物体环境中，硫化氢可以将探针分子中的硝基迅速还原成氨基，致使分子内的电荷转移过程受阻，分子在514nm附近的紫外吸收峰以及在681nm附近的近红外荧光发射峰迅速降低，而在444nm处的吸收和481nm附近的荧光发射显著增强，呈现明显的比色和荧光比率双通道变化。并且荧光强度比率信号(I481nm/I681nm)与H2S的浓度(0-80μM)呈现非常好的线性关系，计算得到的检测限为139nM，具有对低浓度H2S进行定量检测的能力。而线粒体定位基团三苯基膦以及溶酶体定位基团吗啡啉的引入使得探针Mito-NPNM和Lyso-NPNM能够分别在线粒体和溶酶体中实现对内源性硫化氢的选择性检测。此外，这些荧光探针分子还被成功应用于血清内硫化氢含量的检测。这也是第一次以氮杂苝为荧光团设计合成的荧光探针，对荧光探针的发展具有一定的意义。　　第五章为了进一步增加H2S分子的水溶性和荧光发射波长，本章设计合成了以氮杂苝-菁染料为骨架的比率型近红外荧光探针MNC。探针MNC对H2S浓度呈现出良好的比率/比色双通道信号变化，随着H2S浓度的增大，MNC溶液在664nm处的最大吸收峰和757nm处的近红外荧光发射峰都逐渐降低，并最终完全消失;而485nm处的吸收峰和538nm处的荧光发射峰则显著增强，溶液的颜色和荧光都发生了明显的变化，呈现出很好的比率/比色型信号变化，且反应前后荧光比率(I538nm/I757nm)信号与H2S的浓度(0-30μM)呈现出很好的线性关系，计算得到MNC对H2S的检测限为242nM，证明其对H2S高度灵敏且具有定量检测H2S浓度的能力，可以满足对生物环境中H2S浓度检测的要求。由于MNC具有很好的稳定性和优异的光响应特点，因此在活细胞成像领域进行了应用，MNC能够对细胞内的内源性H2S进行成像检测。此外，带有TiO2吸附基团的MNC-SO3化合物可以被用来制成TiO2传感器件，通过膜吸收的比色型变化，实现对了血清内H2S浓度的定量检测。　　第六章次氯酸是生物体中一种具有代表性的活性氧物质，对维持生物体内的代谢平衡和信息传递过程有着十分重要的作用。同时，次氯酸又是生产生活中重要的漂白剂和消毒剂，因此实现对次氯酸的选择性定量检测对于疾病治疗和环境保护有着重要意义。本章以氮杂苝为荧光团，二氰基基团为检测基团，哌嗪为pH敏感基团设计合成了pH敏感性多功能荧光探针PNPM，能够同时实现对环境pH和次氯酸浓度的检测。在中性条件下，PNPM为典型的turn-on型荧光探针，反应之前，由于哌嗪与氮杂苝荧光团之间的PET过程，溶液是没有荧光的，但与HOCl反应后，535nm附近的黄色荧光发射明显增强并且增加幅度与HOCl浓度呈现很好的线性关系，对次氯酸的检测限为31.7nM。而在弱酸性条件下，PNPM则转化成为比率型荧光探针，由于哌嗪基团被质子化，光致电子转移(PET)过程被打断，反应前具有波长为650nm的近红外荧光发射，反应之后近红外荧光逐渐减弱而545nm附近的黄色荧光增强，这种比率信号具有更好的抗干扰能力和更低的检测限(15.3nM)。PNPM对与HClO具有很好的选择性，其它生物分子对其荧光影响很小。此外，PNPM具有优异的光稳定性，并且对次氯酸具有很好的选择性。因此，在实际应用中，该荧光探针成功地在血清和不同水样本中实现了对pH和次氯酸浓度的定量检测，表明其具有潜在的应用价值。