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蜱类为专性吸血的体表寄生虫,其宿主包括爬行类鸟类和哺乳类。森林革蜱广泛分布于我国的东北、内蒙古、河北、山西和新疆等地的森林和草原地区,并传播多种病原体,危害人类健康并且对畜牧业的发展造成损失。关于森林革蜱的研究较为少见并且报道主要集中在宏观生物学方面,如生物学和生态学方面。 本实验通过构建森林革蜱成蜱cDNA文库进行特异性筛选并经NCBI比对后确定获得四条符合防御素特征的基因序列,分别命名为Ds-defensin-1、Ds-defensin-2、Ds-defensin-3和Ds-defensin-4。对这四条基因序列均进行了开放阅读框、等电点、信号肽、成熟肽以及三维结构等方面的预测。 Ds-defensin-1:序列全长为382bp,开放阅读框为213bp,分子量为7384.6Da,等电点为6.07,共编码71个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸,间隔肽长度为15个氨基酸,成熟肽长度为34个氨基酸; Ds-defensin-2:序列全长为280bp,开放阅读框为147bp,分子量为5163.8Da,等电点为4.39,共编码49个氨基酸,信号肽长度为23个氨基酸,间隔肽长度为14个氨基酸,成熟肽长度为12个氨基酸; Ds-defensin-3:序列全长为280bp,开放阅读框为216bp,分子量为7771.0Da,等电点为4.85,共编码72个氨基酸,信号肽长度为22个氨基酸,间隔肽长度为16个氨基酸,成熟肽长度为34个氨基酸; Ds-defensin-4:序列全长为278bp,开放阅读框为216bp,分子量为7500.7Da,等电点为4.61,共编码72个氨基酸,信号肽长度为23个氨基酸,间隔肽长度为14个氨基酸,成熟肽长度为35个氨基酸。 实验进一步选取Ds-defensin-1作为主要研究对象进行后续关于人工合成蛋白生物学功能和真核表达的研究。本实验对人工合成蛋白Ds-defensin-1进行了生物学功能的检测,包括抗菌作用、抗氧化作用和溶血作用。结果显示Ds-defensin-1对革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性,对革兰氏阴性菌也表现出了部分抗菌活性(对粪嗜冷杆菌在大于25μg/mL的浓度下有抗菌活性);经扫描电镜观察,Ds-defensin-1作用于菌体30min后细胞膜表面发生改变,出现颗粒,并伴随内容物外溢,菌体形态出现逐渐卷缩和弯曲,最终导致细胞的破裂和溶解。Ds-defensin-1还表现出了较强的抗氧化活性,当浓度为200μM时对DPPH的清除率为43.40%;当反应进行30min,浓度为200μM时,对ABTS自由基的清除率为53.45%。经检测Ds-defensin-1对人类红细胞未表现出溶血作用。以上结果表明防御素Ds-defensin-1有作为新型抗菌药物的潜力。使用Real-time PCR技术对森林革蜱体内防御素Ds-defensin-1的表达情况进行初步分析,结果显示该基因的表达具有组织特异性,雄蜱中主要在唾液腺和残骸中表达,雌蜱中主要在残骸中表达。 本实验对森林革蜱防御素Ds-defensin-1进行了昆虫杆状病毒载体的构建和蛋白的初步真核表达。实验将Ds-defensin-1基因开放阅读框部分连接至载体pFastBac HT进行定向转座,成功构建了重组昆虫杆状病毒。侵染昆虫细胞Sf9分别获得具感染能力的P1和P2代病毒,使用P2代病毒对活力旺盛的昆虫细胞Sf9进行侵染,最终成功表达出重组蛋白,重组蛋白大小约10.7kDa,目的蛋白大小约7.4kDa,与预期大小相符。所表达出的重组蛋白仍有待进一步纯化和进行功能分析。