口腔鳞癌是一个日趋严重的健康问题,迄今其患者的生存率及预后仍无明显的提升,因此,对于口腔鳞癌的病因学、治疗方法的选择及预后的评价尚需不断完善。Toll样受体(TLRs)作为一类病原体相关分子模式(PAMP)的模式识别受体(PRR)在宿主细胞识别和应答微生物病原体以及启动固有免疫反应如炎症中发挥关键作用。近年来已发现,不仅免疫细胞普遍表达TLRs,而且非恶性或恶性上皮细胞和成纤维细胞也表达TLRs。在炎症-癌症转化中TLRs可被PAMP或损伤相关的分子模式(DAMP)激活并参与肿瘤发生发展,且肿瘤中TLRs表达模式的差异可作为患者诊断和预后的危险因素。研究还发现TLR激动剂可促进树突状细胞(DC)以及其他抗原提呈和细胞(APC)的成熟和活化,增强细胞的吞噬功能,促使APC向引流淋巴结的迁移,诱导优化的肿瘤抗原呈递至T细胞及增加促炎细胞因子(IL-12和TNF-α)和Ⅰ型IFNs的产生,进而增强各种效应细胞的抗肿瘤活性。因此,目前关于不同肿瘤TLRs的表达模式、TLRs激动剂的研发及其用作抗癌免疫治疗方案的探索备受关注。普遍认为,TLRs激动剂的使用能提升机体的抗癌作用,其中TLR3激动剂作为癌症疫苗佐剂被认为具有较高的安全性且耐受性好。可是,目前发现单独的TLR3激动剂治疗没有或仅有较低的的抗肿瘤活性并且还伴有显著的人体毒性;不同的poly(I:C)给药途径也可导致不同的治疗效果。胶质母细胞瘤临床试验表明,患者先接受免疫治疗,再接受化疗的临床应答率显著高于只单独接受化疗的患者。对乳腺癌小鼠模型抑瘤研究结果显示,一旦通过常规剂量的化疗实现了最初的肿瘤控制后,使用低剂量化疗药物就可抑制肿瘤进展并延长荷瘤小鼠的存活时间。这些结果提示,TLR3激动剂与化疗药物的使用剂量和组合优化对于有效治疗肿瘤及减少患者痛苦可能至关重要。已报道口腔鳞状细胞癌也表达某些类型的TLRs,但关于TLRs在口腔鳞状细胞癌的表达模式,特别是TLR3激动剂在其治疗中的作用尚不清楚。肿瘤微环境的建立不仅能够促进肿瘤的发生发展,而且与肿瘤患者的化疗耐受密切相关。肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、浸润的免疫细胞以及成纤维细胞等组成,其中肿瘤相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境中的重要组成成分。大量研究表明,CAF可通过自分泌或者旁分泌作用维持免疫抑制性微环境,促进肿瘤生长及化疗耐受,而有效抑制CAF形成有助于许多癌症治疗。近来发现长链非编码RNA(LncRNAs)参与肿瘤的发生发展,且对LncRNAs的研究主要集中于肿瘤细胞,但是对口腔鳞状细胞癌微环境中的LncRNAs,尤其是CAF的LncRNA谱以及LncRNA在化疗耐受方面的作用尚不清楚。我们推测口腔鳞状细胞癌微环境的LncRNA可能通过调节CAF功能,进而控制肿瘤的生长和化疗耐受。因此,本课题以口腔鳞状细胞癌为研究对象,首先分析了 TLR3激动剂治疗的临床基础;评价了基于TLR3激动剂和顺铂的免疫化疗的不同给药方式、药物剂量和毒副作用;分析了该免疫化疗的特点及其抗肿瘤机制;探究了间质成纤维细胞的LncRNA在药物治疗抵抗作用机制。本研究为口腔鳞癌的新型免疫治疗提供了新依据和新策略,并发现间质LncRNA可以作为肿瘤进展和治疗效果的预后指标。1.口腔鳞癌微环境中不同细胞表达TLR3存在异质性:为了研究TLR3激动剂在口腔鳞癌治疗中的潜在应用价值,我们首先分析TLR3在口腔鳞癌的发展过程的表达变化。结果发现,TLR3在肿瘤细胞和间质成纤维细胞中的表达模式不一致。免疫组织化学(IHC)结果显示,肿瘤细胞以及在肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和CAF均显示阳性TLR3染色,而正常上皮部分的TLR3表达十分微量。通过分析166例口腔鳞癌患者,发现115例(69%)患者的肿瘤细胞阳性表达TLR3,123例(74%)患者的CAF阳性表达TLR3。进一步发现,肿瘤细胞高表达TLR3与较差的患者预后相关,而成纤维细胞高表达TLR3与患者良好的预后有关。提示肿瘤微环境中不同细胞类型TLR3的表达差异与TLR3激动剂的应用治疗效率可能相关。2.TLR3激动剂poly(I:C)加强顺铂的化疗效果且依赖于给药方式:为了探索TLR3激动剂poly(I:C)与口腔鳞癌一线化疗药物---顺铂的联合化疗策略。我们首先在体外研究了不同剂量的顺铂与TLR3激动剂的组合效果,即选择具有较低或者没有细胞毒性的poly(I:C)浓度(20 μg/ml),并将其与不同剂量包括IC25,IC50和IC75的顺铂进行组合使用。结果表明,相比于单独的顺铂处理组,联合抑制肿瘤细胞的效率在IC25浓度的顺铂处理组中达到最大化,在IC50浓度的顺铂处理组中提升不明显,在IC75浓度的顺铂处理组没有联合作用。我们还发现给药顺序在联合化疗中是一个重要因素。当肿瘤细胞用20 μg/ml poly(I:C)预处理细胞12小时后,再用IC25浓度的顺铂和poly(I:C)共同处理细胞48小时,与没有poly(I:C)预先处理组相比,预处理组的联合效果显著升高,并且这种联合治疗的细胞抑制率相当于单独IC50浓度的顺铂诱导的抑制率。这些结果说明,poly(I:C)预处理具有提高低剂量顺铂化疗效果的作用,有序的Poly(I:C)25/DDP2.5免疫化疗策略可能对于肿瘤治疗比较理想。3.poly(I:C)/顺铂联合可促进顺铂的瘤内驻留及克服口腔鳞癌微环境的化疗耐受:我们研究了该联合疗法的作用机制及其特点,发现在不同时间和浓度下poly(I:C)的预处理可显著抑制大部分药物转运蛋白的基因表达,包括P-gp、ABCB4、MRP-1、ABCC2、CFTR、ABCC8、ABCD2、ABCE1、ABCG1 和 ABCG2。下调药物转运蛋白能够来抑制顺铂的外排,从而促进低剂量顺铂在细胞里的驻留,提高化疗效率。进一步发现,在脾脏细胞和肿瘤细胞的共培体系中,即使存在低剂量的顺铂,TLR3激动剂仍然可活化脾脏的DC细胞和细胞毒性T细胞,促进其对肿瘤细胞的杀伤。此外,肿瘤相关成纤维细胞(CAF)作为一个重要的肿瘤治疗抵抗因素,我们发现,即使CAF存在时,Poly(I:C)25/DDP2.5联合治疗仍然能够诱导肿瘤细胞的显著凋亡,提示该联合策略可克服CAF引起的化疗耐受。4.Lnc-CAF调控间质成纤维细胞转化参与口腔鳞癌的生长及治疗:间质成纤维细胞包括正常成纤维(NF)和肿瘤相关成纤维细胞,为了克服CAF的免疫抑制功能,我们探讨了 LncRNA在NF向CAF恶性转化中的作用及其机制,我们分析了 口腔鳞癌患者NF和CAF中的LncRNA谱变化。首先收集了 10例来自口腔鳞癌患者的肿瘤组织及与其配对的正常组织,分离并培养成纤维细胞。在对配对的NFs/CAF进行表型和功能验证后,进行患者临床资料的筛选,然后利用转录组学技术对其中5例配对的NFs/CAF的RNA进行测序,根据其水平及其倍数变化,我们筛选出在NF/CAF转化中显著上调的一个未表征的lncRNALOC400221(也称为 FLJ22447(NCBI 基因 ID:400221)),即 Lnc-CAF。进一步我们通过荧光原位杂交技术分析了 Lnc-CAF在NFs、CAFs和口腔鳞癌组织样品中的表达。结果发现,肿瘤细胞和成纤维细胞均表达Lnc-CAF,但Lnc-CAF在癌巢中的表达似乎CAF。有趣的是,作为参与炎症和癌症的重要细胞因子,IL-33在共表达网络中与Lnc-CAF显著相关,且相比于NF,其在CAF的表达显著上调。通过对临床肿瘤样本分析,发现IL-33主要在肿瘤间质中表达,尤其是CAF中,但很少在癌巢中表达。这些结果提示,显著上调的间质Lnc-CAF/IL-33信号可能参与CAF的恶性转化。为了揭示Lnc-CAF在成纤维细胞中的作用机制,我们在NF上高表达Lnc-CAF或者在CAF中敲低Lnc-CAF。结果发现,Lnc-CAF能够促进NF中α-SMA、波形蛋白和N-钙粘蛋白的表达并促进其向CAF转化,诱导肿瘤增殖。敲低CAF中的IL-33表达,能够抑制CAF的活化表型,削弱CAF支持的口腔癌细胞生长。测序结果提示,Lnc-CAF与IL-33可能存在正相关关系。随后,我们分析了 Lnc-CAF调控IL-33的分子机制,发现上调的Lnc-CAF通过抑制p62依赖性自噬溶酶体降解途径,阻止IL-33的蛋白降解,促进IL-33的功能稳定性,但这个作用与lncRNA支架功能无关。值得注意的是,Lnc-CAF的表达不限于间质成纤维细胞,在肿瘤细胞中也表达,而且口腔鳞癌细胞分泌的外泌体中含有的Lnc-CAF可被间质成纤维细胞摄取,并促进其Lnc-CAF水平的上调以活化Lnc-CAF/IL-33信号,诱导CAF的转化,形成正调控环路以诱导肿瘤增殖和治疗抵抗。这些发现在小鼠移植瘤模型中也得到验证。这些结果提示,口腔鳞癌间质微环境中的Lnc-CAF可能通过调节CAF功能影响肿瘤的生长和化疗。综上所述,本研究提出了一种新型的免疫化疗策略,即基于TLR3激动剂与低剂量顺铂的有序联合治疗;发现TLR3激动剂能促进顺铂的瘤内驻留,提高低剂量顺铂的伤作用,同时活化免疫系统,克服CAF依赖的抑制性肿瘤微环境;发现CAF中高表达的Lnc-CAF/IL33可作为抑制肿瘤生长和克服治疗抵抗的重要分子靶点。