研究目的1．制备由ASG受体介导的MR对比剂半乳糖基化白蛋白-SPIO（Galactose-Bovine serum albumin-SPIO，Gal--BSA-SPIO），通过兔正常肝脏体内外饱和实验测定其与ASG受体的结合活性及其分布；2．建立兔VX2肝癌模型，初步探讨ASG受体介导的Gal--BSA-SPIO在肝脏肿瘤检出与诊断方面的价值；3．测定Gal--BSA-SPIO与人肝脏ASG受体的结合活性及分布，初步探讨Gal--BSA-SPIO在人肝脏MR成像的潜在应用价值；4．对人肝细胞性结节的CT／MR强化特征与其组织病理及免疫组化特征进行对照分析，以更深刻认识肝细胞性结节的影像学特征，并初步探讨Gal--BSA-SPIO在肝细胞性结节的鉴别诊断中是否具有潜在的优越性?材料和方法1．Gal--BSA-SPIO的制备及体内外饱和实验（1）乳糖基白蛋白的制备及测定采用还原胺法，称量牛血白蛋白240mg，乳糖1.2mg，氰基硼氢化钠816mg，溶于30ml 0.2M PH值8.0的磷酸盐缓冲液，37℃水浴搅拌反应24h～120h：取反应液对蒸馏水低温透析三天，间换透析外液；取透析过的溶液低温离心，取上清液，过葡聚糖凝胶柱层析分离，纯化后溶液冰冻干燥即得产品，为白色固体粉末。苯酚—硫酸比色法测定产品中半乳糖的浓度，考马斯亮蓝G250法测定产品中蛋白的浓度，计算糖基化比率。（2） Gal--BSA-SPIO的制备取适量SPIO过Sepharose 4B层析柱，分离出小粒径SPIO，此溶液对PH值7.4标准缓冲液低温透析24h，浓缩至含Fe量8mg／ml，调PH值为6.5左右。取此溶液适量，加入等体积含1％W／V乳糖基白蛋白溶液，冰浴超声波振荡。未结合的糖蛋白用1M Nacl除去，调溶液PH值为7.4，测定含铁量。Malvern-3000HS激光粒度分析仪测定粒径及其分布，透射电镜测定其核心粒径及观察其形态。（3） Gal--BSA-SPIO体内外饱和实验及其分布体外饱和实验取10g新鲜兔肝组织，加入预冷的全细胞生长液，将组织切成1～2mm³的小块，过30目金属筛，用含0.3mg／ml胶原酶的全细胞生长液稀释，37℃孵育30min，冰浴超声波振荡降解，低温离心，取上清（富含细胞膜碎片）。（1）阻断组：将富含细胞膜碎片的溶液2ml用含0.2 mg或2mg的D（+）—半乳糖37℃孵育30min，然后用含10μmol Fe的SPIO或Gal--BSA-SPIO 37℃孵育30min，PBS、超高速离心洗涤2次，以除去未结合的Gal--BSA-SPIO和SPIO，最后用6ml全细胞生长液悬浮。（2）非阻断组：将富含细胞膜碎片的溶液2ml直接用含10μmol Fe的Gal--BSA-SPIO或SPIO 37℃孵育30min，洗涤2次，6ml全细胞生长液悬浮。各溶液用1.5T MR扫描、测量T2驰豫时间，统计学比较分析。体内饱和实验健康新西兰白兔6只，随机分为两组，阻断组和非阻断组，每组3只，均分别行MR平扫及增强扫描。平扫及增强所用序列：SE T2WI．TR600ms，TE 20ms、80ms，均作轴状位扫描。增强扫描：阻断组预先注入D（+）—半乳糖（2mg／kg）预饱和肝细胞膜上的ASG受体，30min后注入10μmolFe／kg Gal--BSA-SPIO，30min后行MR扫描。非阻断组直接注入10μmolFe／kgGal--BSA-SPIO，30min后行同上扫描。分别测量增强前及增强后实验动物肝脏T2值。分布实验取新西兰白兔2只，分别缓慢静注20μmolFe／kg SPIO及Gal--BSA-SPIO，30min后处死动物，快速取其肝脏及脾脏组织，同时做电镜标本（肝）和石蜡标本（肝、脾）处理。分别于光镜和透射电镜下观察其分布。2．Gal--BSA-SPIO在兔VX2肝癌模型的应用（1）兔VX2肝癌模型的建立：从VX₂荷瘤种兔肿瘤边缘切取生长活跃的鱼肉样组织放于少量生理盐水中，用眼科剪将其剪成约0.5～1mm³瘤块备用。取健康新西兰白兔麻醉，暴露腹腔、将肝脏一叶轻轻牵至体外，以眼科镊在较厚的位置轻轻刺破肝组织，将1粒VX2瘤小块埋入其中。每只兔种植1～3处肿瘤。（2）动物分组：肝VX2肿瘤新西兰白兔20只随机分为2组：SPIO组和Gal—BSA-SPIO组，各10只，每组再随机分为两个剂量组（Ⅰ和Ⅱ），组Ⅰ为5μmol Fe／kg；组Ⅱ为10μmol Fe／kg。（3） MR扫描：1.5T MR头部线圈进行平扫及增强扫描，层厚3-5mm，FOV：87.5×100；扫描序列及参数为：SE T₁ WI：TR300ms，TE20ms、3000ms；SE T₂WI：TR600ms，TE 20ms、80ms；TSE T₂Wh TR3500ms，TE15ms、105ms；GRE T₂^* WI：TR600ms，TE 15ms，18°翻转角度；轴状位、冠状位或矢状位扫描。增强：按实验分组分别经兔耳缘静脉缓慢注入对比剂，30min后行MR扫描，扫描条件同平扫一致。（4）图像观察与测量：观察分析实验动物肝脏VX2肿瘤成瘤情况及MR特征；测量增强前及增强后各组实验动物肿瘤、肝脏的T₁及T₂值；测量增强前后各组实验动物肝脏及肿瘤的信号强度，计算肝脏的信噪比（SNR）、肝脏信号强度下降百分比（PSIL）及肿瘤—肝脏对比噪声比（CNR）。（5）统计学比较分析：采用配对t检验比较各组增强前后肝脏T₁值、T₂值、SNR及CNR是否有显著性差异；采用单因素方差分析比较不同组间T₁值、T₂值、SNR和CNR增强前后差值及肝脏PSIL是否有显著性差异；采用单因素方差分析比较增强前及增强后不同扫描序列间肝脏SNR及CNR是否有显著性差异。多重比较用LSD或Dunnett’s T3，P＜0.05认为有显著性差异。3．ASG受体介导的Gal--BSA-SPIO人肝脏MR受体成像初步研究（1） Gal--BSA-SPIO与人肝脏ASG受体亲和力的初步测定收集外科手术新鲜肝癌标本6例，肝硬化标本4例，正常肝组织3例，按前述（兔肝体外饱和实验）方法制备细胞膜悬液，然后行MR扫描及T2值测定。采用单因素方差分析和独立样本t检验进行统计学比较分析。多重比较用LSD法或Dunnett’s T3。P＜0.05认为有显著性差异。（2）人正常肝脏及病变（新鲜标本）受体分布实验取出低温贮藏的人肝脏不同新鲜组织，冰冻切片（2～4μm），室温风干，用SPIO、Gal--BSA-SPIO及PBS 37℃孵育20s，洗涤3次，除去未结合的SPIO或Gal--BSA-SPIO，室温风干24h，Perl’s染色。显微镜下观察。（3）人肝不同组织（石蜡标本）受体分布实验收集肝脏石蜡标本27例，包括小肝癌12例，转移瘤3例、胆管细胞癌2例、肝硬化再生结节5例，肝细胞结节状增生3例、血管瘤3例、囊腺瘤1例。常规切片（2～4μm），65℃烤箱烤片60min，二甲苯脱蜡至水，室温风干，用SPIO及Gal--BSA-SPIO 37℃孵育10min，PBS洗涤3次，除去未结合的SPIO或ALC-BSA-SPIO，室温风干24h，Perl’s染色。显微镜下观察。（4） CD34免疫组织化学染色对18例肝细胞性结节（小肝癌10例，肝硬化结节5例及肝细胞结节状增生3例）进行CD34标记，染色方法采用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶连结法（SABC法）；显微镜下观察，并按Weidner等方法计数10例肝细胞癌肿瘤微血管密度（MVD）。（5）观察18例肝细胞性结节的CT／MR强化特征，并与其组织病理、免疫组织化学进行对照分析。结果1．Gal--BSA-SPIO的制备及体内外饱和实验结果（1） Gal--BSA-SPIO的测定结果：24h、48h、72h、96h、120h，乳糖基白蛋白的糖基化比率分别为8、15、27、32、38。Gal--BSA-SPIO含铁量为2.8mg／ml；平均体积粒径为34.4nm，多分散性为0.35；核心粒径为14.8nm，呈类圆形，大小均匀，表面平滑完整，部分有重叠。（2） Gal--BSA-SPIO体外饱和实验结果：用造影剂孵育前，不同浓度阻断组和非阻断组T2值差异无显著性意义（P＞0.05）。细胞膜悬液用SPIO孵育后，不同浓度阻断组与非阻断组之间差异无显著性意义（P＞0.05）。细胞膜悬液用Gal--BSA-SPIO孵育，非阻断组孵育后T2值减低，与孵育前有显著性差异（P＜0.05），与SPIO孵育后亦有显著性差异（P＜0.05）；不同浓度的D（+）-半乳糖预先饱和ASG受体后，细胞膜悬液用Gal--BSA-SPIO孵育后T2值升高，与直接用Gal--BSA-SPIO孵育有显著性差异（P＜0.05），不同浓度的D（+）-半乳糖之间亦有显著性差异（P＜0.05）。（3） Gal--BSA-SPIO体内饱和实验结果：注射Gal--BSA-SPIO后肝脏T2驰豫时间明显缩短，MR信号明显减低，与周围噪声相当或略低，呈现“黑肝”效应；预先用D（+）-半乳糖预饱和肝ASG受体后，肝脏T2驰豫时间升高，但肝脏MR信号依然很低。（4）受体分布结果：注射SPIO后，兔肝Kupffer细胞内可见较多蓝染铁颗粒沉着，肝细胞内无蓝染铁分布，脾脏内也可见到较多蓝染铁颗粒；注射Gal--BSA-SPIO后，兔肝细胞内可见较多蓝染铁颗粒沉着，而仅有少数Kupffer细胞内可见蓝染铁颗粒沉着，脾组织内罕见蓝染铁颗粒。电镜下观察，注射Gal--BSA-SPIO后肝细胞溶酶体内可见较多高电子致密颗粒，而仅有极少数Kupffer细胞溶酶体内亦可见高电子致密颗粒；注射SPIO后，肝实质细胞内无高电子致密颗粒，而Kupffer细胞溶酶体内可见较多高电子致密颗粒。2．兔VX2肝癌模型MR成像结果（1） 20只兔肝VX2肿瘤均建模成功，MR共检出肿瘤28个，其中SPIO组检出13个，病理解剖15个；Gal-BSA-SPIO组检出15个，病理解剖16个。肿瘤呈类圆形，灰白色，部分肿瘤有纤维包膜，最小直径3mm，最大直径1.2cm。（2） T值测量结果注射SPIO后，正常肝脏T1与平扫均无显著性差异（P＞0.05），注射Gal-BSA-SPIO后，正常肝脏T1与平扫均有显著性差异（P＜0.05），T1增强前后差值不同组间均无显著性差异（F=1.059，P=0.385）。各组增强后正常肝脏T2与平扫均有显著性差异（P＜0.05）：T2增强前后差值不同组间差异均有显著性（F=19.295，P=0.000），组间多重比较示T2增强前后差值101.μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO与其它各组均有显著性差异（P＜0.05），5μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO与同剂量SPIO有显著性差异（P=0.001），与10μmol Fe／kg SPIO无显著性差异（P=0.080）。各组肝VX2肿瘤T1及T2增强前后均无显著性差异（P＞0.05），不同组间T1及T2增强前后差值亦无显著性差异（P＞0.05）。（3）肝脏SNR测量结果SE 300／20 5μmol Fe／kg SPIO增强后肝脏SNR与平扫前无显著性差异（F=2.098，P=0.090），其余各序列不同剂量的SPIO或Gal-BSA-SPIO增强后肝脏SNR与增强前均有显著性差异（P＜0.05）；SE 300／20不同组间SNR增强前后差值无显著性差异（F=2.624，P=0.074）；其余各序列不同组间增强前后差值均有显著性差异（P＜0.05），组间多重比较：SE 600／80、TSE 3500／105及GRE 600／15 10μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO与其它各组均有显著性差异（P＜0.05），5μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO与5μmol Fe／kg SPIO均有显著性差异（P＜0.05）。各组不同序列间肝脏SNR均有显著性差异（P＜0.05）。（4）肝脏PSIL测量结果各序列不同组间肝脏PSIL均有显著性差异（P＜0.05），组间多重比较：SE 300／20 10μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO与5μmol Fe／kgGal-BSA-SPIO及10μmol Fe／kg SPIO有显著性差异（P＜0.05）：SE 600／80除5μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO与10μmol Fe／kg SPIO无显著性差异外（P=0.159），其余各组间均有显著性差异（P＜0.05）；TSE3500／105及GRE600／15各组间均有显著性差异（P＜0.05）。各组不同序列间肝脏PSIL均有显著性差异（P＜0.05），不同序列间多重比较：5μmol Fe／kg SPIO GRE600／15与SE600／80及TSE3500／105有显著性差异（P＜0.05），10μmol Fe／kg SPIO及不同剂量的Gal-BSA-SPIO除SE600／80与TSE3500／105无显著性差异外（P＞0.05），其它不同序列间均有显著性差异（P＜0.05）。（5）肿瘤—肝脏CNR测量结果各序列不同剂量的SPIO或Gal-BSA-SPIO增强后CNR与平扫均有显著性差异（P＜0.05），CNR增强前后差值各序列不同组间亦均有显著性差异（P＜0.05）。组间多重比较：SE300／20 10μmol Fe／kgGal-BSA-SPIO与不同剂量SPIO均有显著性差异（P＜0.05），SE600／80、TSE3500／105、GRE600／15不同组间两两比较均有显著性差异（P＜0.05）。平扫各组不同序列间CNR均有显著性差异（P＜0.05），组间多重比较：10μmol Fe／kg SPIO组SE 300／20与SE600／80 CNR无显著性差异（P=1.0），其余各组不同序列间CNR均有显著性差异（P＜0.05）。增强后各组不同序列间CNR均有显著性差异（P＜0.05），组间多重比较：不同剂量的SPIO及5μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO增强后，SE 600／80与TSE 3500／105无显著性差异（P＞0.05），其它不同序列间均有显著性差异（P＜0.05）；10μmol Fe／kg Gal-BSA-SPIO增强后，不同序列间CNR均有显著性差异（P＜0.05）。（6）组织病理学HE染色，VX2肿瘤组织以鳞癌为主，可见少量腺癌成分，部分肿瘤组织周围可见纤维组织增生、形成纤维性假包膜。瘤周肝组织基本正常。铁染色，注射SPIO组，兔正常肝组织Kupffer细胞内可见蓝染铁颗粒，而肝实质细胞内未见蓝染铁颗粒，肿瘤组织内亦未见蓝染铁颗粒；注射Gal-BSA-SPIO组，兔正常肝组织肝细胞内可见较多蓝染铁颗粒，仅极少数Kupffer细胞内可见蓝染铁颗粒，肿瘤组织内未见蓝染铁颗粒。3．ASG受体介导的Gal--BSA-SPIO人肝脏MR受体成像初步研究（1）受体亲和力测定结果正常肝组织用不同对比剂孵育后，T2值Gal--BSA-SPIO和SPIO有显著性差异（P=0.003）。肝硬化组织用不同对比剂孵育后T2值Gal--BSA-SPIO和SPIO有显著性差异（P=0.001）。肝癌组织用不同对比剂孵育后T2值SPIO和GaI--BSA-SPIO无显著性差异（P=0.829）。孵育前及不同对比剂孵育后，正常肝组织和肝硬化组织T2值均有显著性差异（P＜0.05）。（2）受体分布正常肝组织SPIO孵育后肝细胞膜及胞内均未见蓝染铁，GaI-BSA-SPIO孵育后肝细胞膜及胞内可见大量蓝染铁颗粒；轻中度肝硬化未孵育或SPIO孵育后，肝细胞内可见少量蓝染铁颗粒沉积，细胞膜无蓝染，Gal-BSA-SPIO孵育后肝细胞膜及细胞内可见较多蓝染颗粒沉积；重度肝硬化及癌旁肝硬化组织未孵育及SPIO或Gal-BSA-SPIO孵育后细胞内均可见大量蓝染铁颗粒沉积，Gal-BSA-SPIO孵育后肝细胞膜未见蓝染铁沉积。未孵育及SPIO或Gal-BSA-SPIO孵育后，肝细胞癌罕见蓝染铁颗粒分布，胆管细胞癌及转移瘤均无蓝染铁分布，肝细胞结节状增生及腺瘤组织可见蓝染铁颗粒散在分布，而血管瘤组织无蓝染铁颗粒分布。（3） CD34表达及MVD结果肝细胞结节状增生及肝硬化结节CD34阳性主要分布于汇管区和纤维间隔中的小血管，本组2例结节状增生和1例肝硬化结节在肝血窦壁也见较多的CD34淡黄色表达；10例肝细胞癌组织内呈棕黄色至棕褐色窦隙状弥漫分布，透明变细胞癌CD34无表达或散在弱阳性表达。5例富血供小肝细胞癌MVD值为121.5±40.4：5例乏血供小肝细胞癌MVD值为133.5±27.8。（4）肝细胞结节CT／MR强化特征3例肝细胞结节状增生，平扫均为低密度，其中2例密度欠均匀，增强扫描动脉期明显强化，静脉期及延迟扫描为略高或等密度，病灶周围可见强化血管影，其中1例可见中心瘢痕（延迟强化）；此外1例动脉期及静脉期或延迟扫描均未见明显强化。5例肝硬化结节，2例平扫为等或稍低密度，增强扫描动脉期呈等密度，静脉期呈等或稍低密度；MR检查1例，未见明确结节，此例同时发生原发性肝癌：另2例CT平扫为等密度，动脉期病灶均可见中等偏高强化，静脉期为等密度，延迟扫描为等或稍低密度。小肝癌富血供（动脉期强化大于20个单位）、乏血供（动脉期不强化或强化小于20个单位）各5例。结论1．Gal--BSA-SPIO与肝细胞膜ASG受体具有良好的结合活性，其主要作用于肝实质细胞，可明显缩短肝脏T2驰豫时间，具有良好的肝脏负向强化效果；2．Gal-BSA-SPIO可显著提高肿瘤—肝脏对比噪声比；含铁量相同的Gal-BSA-SPIO对肝脏的负向强化效果优于SPIO；Gal-BSA-SPIO增强效果最佳的序列是GRE *T2WI，其次是SE T2WI和TSE T2WI，SE T1WI最差。3．正常肝组织、轻中度肝硬化组织、肝细胞结节状增生及腺瘤有丰富或较多的Gal-BSA-SPIO聚集；重度或癌旁肝硬化组织摄取Gal-BSA-SPIO明显减少；肝细胞癌罕见Gal-BSA-SPIO分布；肝血管瘤及胆管细胞癌及转移瘤无Gal-BSA-SPIO分布；Gal-BSA-SPIO在人肝脏MR成像如肿瘤检出及良、恶性肿瘤的鉴别方面具有良好的潜在应用价值。4．小肝癌主要由肝动脉供血，多呈富血供表现，CD34呈弥漫强阳性表达；动脉期不强化或伴点片状不强化最主要的原因是坏死和癌细胞透明变；透明变细胞癌不强化的原因在于其微血管分布极少（CD34无表达或弱阳性）、血供差，但其内有少数ASG受体分布，是肿瘤分化好的一种标志。5．Gal-BSA-SPIO在肝细胞性结节的良恶性鉴别方面具有潜在的优势，但对于部分不典型增生结节（DN）和高分化肝细胞癌仍具有一定的局限性，尤其对于重度肝硬化基础上的肝细胞性结节的诊断与鉴别诊断价值可能有限。