研究背景结直肠癌(Colorectal cancer)是最常见的恶性肿瘤之一,其发病率高居世界第三位,死亡率高居世界第二位,严重威胁人类生命健康。近年来,结直肠癌在中国的发病率也在增加,发病率居我国恶性肿瘤第五位,死亡率居第四位。结直肠癌的发生是一个复杂的多因素过程,其中不健康生活习惯、环境因素,遗传因素以及基因的异常表达在结直肠癌的发生发展中都起到了重要作用。早期结直肠癌患者生存率可以通过综合治疗比如手术切除,化学治疗,放射治疗以及分子靶向治疗得到改善。然而晚期结直肠癌患者由于治疗效果不理想,死亡率居高不下。由此可见,早期发现与诊断对于结直肠癌患者预后起重要作用。因此,寻找与结直肠癌诊断和治疗相关的标志物和潜在的靶分子十分必要。基因表达异常可能直接或间接影响非编码RNA和蛋白质表达,包括小RNA(MicroRNA,miRNA),长链非编码 RNA(long non-coding RNA,LncRNA)和环状非编码RNA(circRNA)等,从而进一步影响这些分子参与调节的生物学功能,包括细胞增殖、衰老、凋亡、迁移、侵袭等。目前,大量关于非编码RNA的研究表明,多种非编码RNA在细胞增殖、侵袭、迁移等方面起到重要作用。LncRNA是一种长度超过200nt,但是未翻译成蛋白质的核苷酸序列。许多研究结果表明长非编码RNA具有复杂的生物学功能,在癌症、神经退行性疾病和心血管疾病的发生发展中起到重要作用。此外,LncRNA可以通过内源性竞争作用吸附miRNA或者结合蛋白作为蛋白的辅因子调控某个信号通路进而影响多种疾病的发生发展。目前,大量针对非编码RNA的研究,已证明多种非编码RNA与细胞增殖、侵袭迁移相关。在许多肿瘤内LncRNA可以充当抑癌分子,比如在胃癌细胞内LncRNA SLC25A5-AS1表达降低,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡并且与肿瘤体积,肿瘤分期以及淋巴结转移有关。在某些肿瘤内LncRNA起到促癌作用,比如在胰腺癌细胞内AGAP2-AS1表达增加,并且与肿瘤体积和病理分期有关,此外还可以影响细胞增殖,凋亡,侵袭和转移。目前,许多实验证明LncRNA与结直肠癌的发生发展密切相关,例如LncRNAGAS5可以抑制细胞迁移与侵袭,LncRNABDNF-AS可以抑制细胞增殖和迁移。然而许多LncRNA在结直肠癌中的作用尚不清楚。德国凯杰公司的 Human Cancer Pathway Finder RT2 LncRNA PCR Array 汇总了目前与人类癌症发生发展密切相关的84个LncRNA。我们利用该PCR ARRAY,随机选取三对结直肠癌组织与其对应的非癌邻近组织检测癌症相关的LncRNA的表达差异,并进行后续验证实验。TRERNA1(Translation regulatory long non-coding RNA 1)基因位于 SNAI1附近,并且在胃癌和肝癌中高表达,且通过促进上皮-间充质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)途径进而促进胃癌细胞和肝癌细胞的转移。然而TRERNA1在结直肠癌中的作用尚不清楚,因此本实验首次研究了TRERNA1在结直肠癌中的表达情况及其在结直肠癌发生发展中的作用。实验目的寻找在结直肠癌异常表达的LncRNA,并进行组织和细胞水平的验证,分析TRERNA1结直肠癌发生发展的相关性,寻找与结直肠癌诊断和治疗相关的标志物和潜在的靶分子。实验方法1.利用PCR ARRAY检测在结直肠癌中异常表达的LncRNA随机选取三对结直肠癌组织与其相应的非癌邻近组织,按照Human Cancer Pathway Finder RT2 LncRNA PCR Array试剂盒操作手册进行操作,通过qRT-PCR,检测在结直肠癌中异常表达的LncRNA。2.利用qRT-PCR对异常表达的LncRNA在组织中进行验证根据PCR ARRAY结果,我们选取表达具有明显变化(*P<0.05)的LncRNA进行后续实验。我们选取130对结直肠癌组织与其非癌邻近组织通过qRT-PCR对PCR ARRAY结果进行验证,分析TRERNA1的表达水平与结直肠癌患者相关病理参数的相关性,评估其是否能作为结直肠癌的潜在诊断标志物。3.分析LncRNA TRERNA1与临床病理的相关性通过Kaplan-Meier分析TRERNA1与结直肠癌病人的预后与生存率的关系,判断TRERNA1是否可以作为结直肠癌预后与治疗的靶分子。4.TRERNA1对结直肠癌细胞细胞功能的影响设计并合成TRERNA1的小干扰RNA转染至结直肠癌细胞HCT-8和HCT-116中,用qRT-PCR检测其对TRERNA1基因表达的干扰效果,通过Transwell迁移实验检测下调TRERNA1对结直肠癌细胞迁移能力的影响;通过Transwell基质胶侵袭实验检测下调TRERNA1对结直肠癌细胞侵袭功能的影响。5.TRERNA1调控结直肠癌转移分子机制的初步研究检测TRERNA1与肿瘤转移侵袭相关标志分子相关性。敲低TRERNA1的达后,检qRT-PCR与Western blot测HCT-8与HCT-116细胞中侵袭转移相关分子的表达。并进行生物信息学分析初步研究TRERNA1调控CRC转移的分子机制6.生物信息学分析TRERNA1调控Snail表达的分子机制通过生物信息学软件寻找可以与TRERNA1和Snail共同结合的miRNA,并且查阅文献分析miRNA的功能,探究TRERNA1是否通过内源竞争性作用调控Snail的表达。实验结果1.选择差异表达的LncRNA利用PCRARRY分析相关数据,结果显示在结直肠癌组织和邻近非癌组织内,LncRNATRERNA1表达具有明显差异,变化倍数为21.88(P=0.045341)。此外,结果同时显示LncRNA BANCR表达也具有明显差异,变化倍数为21.14(P=0.005813)。因此,根据分析结果,我们选择LncRNA TRERNA1作为在结直肠癌中的研究对象,进一步探讨其在结直肠癌中相关作用。2.LncRNATRERNA1在结直肠癌组织中高表达利用qRT-PCR检测130对结直肠癌组织和邻近非癌组织,实验结果表明,与非癌邻近组织相比,TRERNA1在结直肠癌组织中表达明显升高(**P=0.008)。3.LncRNATRERNA的表达与临床病理相关性在结直肠患者中,我们通过临床病理参数之间的相关性分析发现,LncRNA TRERNA1的表达与患者的年龄,性别或肿瘤的生长位点、肿瘤分化、淋巴结转移无显著性差异(*P>0.05),但与肿瘤的生长大小、分期、远端转移和神经性侵袭有关。4.敲低LncRNA TRERNA的表达够抑制HCT-8和HCT-116细胞的侵袭迁移能力利用小干扰RNA在HCT-8细胞中敲低TRERNA1的表达,通过transwell铺胶与不铺胶实验检测TRERNA1对结直肠癌细胞体外侵袭迁移能力的影响。Transwell实验结果显示实验组与对照组相比,小室下层的细胞数量明显减少,HCT-8细胞的迁移能力受到明显抑制(**P<0.01)。Transwell铺基质胶实验结果显示实验组与对照组相比,小室下层的细胞数量明显减少,HCT-8细胞的侵袭能力受到明显抑制(**P<0.01)。5.LncRNATRERNA1与结直肠癌病人的预后相关根据LncRNATRERNA1在结直肠癌组织中的表达水平,以表达中位数作为划分标准,将130名患者分为两个亚组,分别为表达高水平组和表达低水平组。通过Kaplan-Meier分析研究了 LncRNATRERNA1表达水平与CRC患者的总体存活的相关性。存活曲线的结果显示具有较高LncRNATRERNA1表达水平的结直肠癌患者的总存活率明显短于具有低LncRNATRERNA1表达水平的患者。此外,多变量分析表明,除转移距离和患者淋巴结转移外,LncRNATRERNA1的高表达与CRC患者的预后较差相关。6.TRERNA1可能通过调控snail的表达影响结直肠的转移根据qRT-PCR结果,TRERNA1在结直肠癌中的表达与snail的表达呈正相关(***P<0.001)。在敲低 TRERNA1 后,HCT-8 与 HCT-116 细胞中 snail 的mRNA与蛋白与水平均降低(***P<0.001),且snail下游E-cadherin的蛋白水平升高。生物信息学分析发现,TRERNA1和snail可共同结合miR-1207-5p。因此,TRERNA1可能通过内源竞争性作用结合miR-1207-5p进而调控snail的表达影响上皮-间质转化通路调控结直肠癌的转移。实验结论在结直肠癌内,LncRNATRERNA1可以促进疾病的发生发展,并且与结直肠癌患者预后相关,可能与结直肠癌转移有关。