研究背景及意义结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤,好发于直肠与乙状结肠交界处,以40～50岁年龄组发病率最高,男女之比为2-3：1。结直肠癌是男性第三常见的肿瘤,女性第二常见的肿瘤。结直肠癌的症状和体征取决于肿瘤在肠道内位置以及肿瘤在体内扩展的情况。早期结直肠癌诊断困难,因为其没有症状或症状不明显,随着肿瘤的进展,其症状和体征逐渐出现。常见的报警症状有：顽固的便秘、大便潜血、大便变细、食欲不振及体重下降等等。当50岁以上的人出现便血及贫血时,更应被列为高风险特征。结直肠癌主要分为三个类型,分别为腺癌、黏液腺癌、未分化癌。肿瘤的形态大体呈息肉状、溃疡型等。结肠肿瘤可沿肠壁环行发展,沿肠管纵径上下蔓延或向肠壁深层浸润,除经淋巴管、血流转移和局部侵犯外,还可向腹腔内种植或沿缝线、切口面扩散转移。慢性结肠炎患者、结肠息肉患者、男性肥胖者等为易感人群。对可进行手术的患者而言,手术是最常用的治疗手段,其次是化学疗法、放射疗法、生物疗法及中医中药等治疗。然而,术后肿瘤的复发和癌细胞的转移是非常常见的。因此,目前迫切需要找到结直肠癌发病的潜在分子机制,进而发现治疗这种疾病的分子靶点。近期,真核生物内生性的,非编码的小RNA(19-22个核酸)microRNAs (miRNAs)被发现能够通过与3’-非翻译区(3’-UTR)的不完全杂交弱化甚至终止mRNA的翻译。在几种具有调控细胞增殖功能的miRNA中,miR-454被证实是数种癌症的肿瘤细胞增殖的重要决定性因素。在此之后,有许多miR-454作用的靶基因被发现。在这些靶基因中,肿瘤抑制因子(CYLD)已被证实与癌细胞凋亡有关。细胞增殖,作为肿瘤的最重要特征,是恶性肿瘤,尤其是结直肠癌的最主要致死因素。但到目前为止,结直肠癌与miR-454表达间的关系还未被阐明。在本研究中,我们报道了结直肠癌中miR-454与结直肠癌细胞的增殖有关。更多研究表明miR-454可以通过直接作用于CYLD基因的3’-UTR来抑制其表达,进而促进结直肠癌细胞的增殖。由此我们做出推断,以miR-454为分子靶点对结直肠癌进行治疗,可能是针对结直肠癌新的、有效的治疗方法。本研究分为五个部分进行阐述。实验一研究目的：检测结直肠癌组织中miR-454的表达水平。研究方法：经八位结直肠癌患者同意获得其人结直肠癌组织以及相应癌旁组织(TAT),用qRT-PCR评估检测结直肠癌组织、癌旁组织的miR-454表达水平。另外,选用人类CRC细胞株SW403, HT-29, COL0320DM, COL0205, SW480, KM202L, SW620和正常结肠细胞FHC,共八种细胞系,同样用qRT-PCR评估检测其miR-454表达水平。研究结果：从各qRT-PCR所得结果可以看到,与癌旁组织相比CRC组织中miR-454的表达水平明显上调,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。并且所有7个测试的结直肠癌细胞系的miR-454表达水平均高于正常结肠细胞系FHC。这些结果表明,可以认为miR-454在结直肠癌发病过程中发挥了重要作用。同时,这些结果表明,miR-454在结直肠癌组织中的表达显著增加,提示miR-454可作为结直肠癌患者的预后指标。研究结论：miR-454在结直肠癌组织和结直肠癌细胞系中的表达显著,说明miR-454基因对结直肠癌发病有重要意义。实验二研究目的：研究miR-454基因对结直肠癌细胞增殖的促进作用研究方法：以脂质体为载体,将mir-454mimics,以及作为控制组的miR-454抑制基因miR-454 inhibitor (miR-454-in)转染SW480细胞,并通过qRT-PCR评估转染后两种细胞的miR-454水平,验证转染成功。使用两种细胞进行MTT、平板克隆形成,非锚定独立生长实验,分析miR-454对结直肠癌细胞增殖能力的影响。研究结果：MTT法的结果显示,miR-454 mimics的转染显著增加了SW480细胞的增殖率,而集落形成实验进一步证实了这一点。引人注目的是,我们发现,miR-454的表达大大增强了SW480细胞的锚地独立生长能力。相反,转染了miR-454 inhibitor (miR-454-in)的SW480细胞的细胞增长率和集落数与转染了miR-454 mimics的SW480细胞相比显著降低。此外,转染了miR-454 inhibitor (miR-454-in)的SW480细胞的锚地独立生长能力显著下降。这些结果表明,在体外环境下,miR-454提高了结直肠癌细胞的致瘤性。研究结论：miR-454基因能够显著促进结直肠癌细胞增殖活动。实验三研究目的：研究miR-454对CYLD表达水平的影响研究方法：人们普遍认为miRNA通过调节下游靶基因的表达来发挥它们的功能。利用生物信息学方法,我们预测了miR-454的潜在作用目标：CYLD。这个含有一处miR-454结合部位的肿瘤抑制基因,被选定进行进一步的分析。为了确定miR-454是否影响了CYLD的表达,我们选用miR-454 mimics, miR-454 inhibitor (miR-454-in)转染的SW480细胞和正常SW480细胞进行CYLD表达的检测。检测手段包括用western blot分析三种细胞CYLD蛋白分泌水平；再将miR-454 mimics转染至具有CYLD3’-UTR突变基因的SW480细胞,将这种细胞通过荧光素酶活性测定法与miR-454 mimics, miR-454 inhibitor转染的SW480细胞和正常SW480细胞比较CYLD基因表达情况,验证miR-454与CYLD基因的结合位点。研究结果：western blot分析结果表明,miR-454 mimics显著抑制了SW480细胞的CYLD蛋白水平,而miR-454-in明显促进了CYLD蛋白的表达。荧光素酶活性测定实验显示,在miR-454 mimics转染的SW480细胞中可以观察到荧光素酶活性减少,而且其减少幅度与转染的量呈线性相关,然而在miR-454-in转染的SW480细胞中因为对miR-454受到抑制而使CYLD基因的荧光素酶活性增加。同时,转染进入的miR-454基因对3’-UTR突变型SW480细胞的荧光素酶活性没有影响。将得到这几个结果综合来看,可以确定CYLD是miR-454的目的基因,3’-UTR是miR-454的作用位点。研究结论：MiR-454通过结合3’-UTR直接与CYLD结合,降低其表达水平。实验四研究目的：miR-454对有关癌细胞增殖的其他基因的影响研究方法：以上的结果已经表明,mir-454能促进CRC细胞的生长和增殖,CYLD是miR-454的直接目标。之前的报道的研究表明CYLD与细胞增殖密切相关。我们对两种关键的细胞增殖调控因子c-Myc以及cyclin Dl蛋白的表达水平也进行了检测。c-Myc基因是一个核转录因子,其靶基因对细胞增殖、分化、细胞凋亡和其他细胞功能有重要作用,细胞周期蛋白cyclin D1也属于被c-Myc基因调控之列。我们通过western blot的方法检测c-Myc基因和cyclin D1蛋白在对照SW480细胞,转染miR-454 mimics和miR-454-in的SW480细胞的表达调控。研究结果：western blot检测结果表明,相对于对照细胞,cyclin D1和c-myc的表达在转染miR-454mimics的SW480细胞中上调,但在转染miR-454-in的SW480细胞中降低。这些结果提供了进一步的证据证明miR-454对CRC细胞增殖的起到重要作用。研究结论：总而言之,我们的研究结果表明,miR-454调节了细胞增殖的调控因子cyclin D1和c-myc基因,进而对细胞增殖产生相关作用。实验五研究目的：miR-454抑制CYLD表达与其促进癌细胞增殖的关系研究方法：为了进一步研究CYLD的减少在miR-454增强CRC细胞增殖中的作用,我们首先研究了CYLD下调对CRC细胞增殖的影响。我们将CYLD的两种siRNA (Small interfering RNA):CYLD-siRNA#1和CYLD-siRNA#2转染入已先期转染miR-454-in的SW480细胞系中,用免疫印迹分析(western blot)检测CYLD在相应SW480细胞系中的表达,利用平板克隆形成,锚定非依赖生长分析检测相应SW480细胞系的增殖情况。研究结果：免疫印迹分析表明, CYLD-siRNA#1和CYLD-siRNA#2均能有效降低CYLD在转染了mir-454-in的SW480细胞中的表达,形成了CYLD沉默。平板克隆形成,锚定非依赖生长分析显示在转染了mir-454-in的SW480细胞中的CYLD沉默对细胞增殖中起到加强作用。总而言之,这些结果证实,直接的CYLD表达下调是是miR-454诱导CRC细胞增殖的必要条件。研究结论：CYLD的抑制是miR-454诱导CRC细胞增殖的必要条件