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目的:针对TCRαC区设计出三个CRISPR靶向编辑位点,对这三个编辑位点进行筛选,找出编辑效果较好的质粒并对其脱靶率进行评估。考察CRISPR/Cas系统对人源的不同类型的细胞系的基因编辑情况,并初步探寻人源不同类型细胞的基因修复机制。针对CRISPR-Cas9-TRAC系统构建相应的腺病毒载体,为后续对于人源T细胞TCR基因的编辑奠定基础。方法:一、CRISPR-Cas9-TRAC系统的构建及功能、脱靶率的评估利用CRISPR网站(http://crispr.mit.edu/)提供的靶向编辑位点筛选工具,针对TCRαC区设计出3个基因编辑位点,并构建CRISPR-Cas9-TCR系统,通过磷酸钙转染法将其转入293T细胞系中,利用流式细胞术法和PCR结合T-A克隆测序等方法筛选出编辑效果较好的质粒并验证其编辑效率。然后,利用脱靶在线预测网站(http://crispr.mit.edu/;https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/index.php;http://cas9.cbi.pku.edu.cn/;http://gt-scan.braembl.org.au/gt-scan/submit),预测其潜在的脱靶位点,综合选取分值较高的10个潜在脱靶位点,分别设计出相应的上下游引物进行PCR扩增后测序,检测其是否存在脱靶现象。二、CRISPR-Cas9系统对不同细胞系基因编辑情况的对比为进一步分析不同细胞的基因修复系统是否存在差异,将筛选出的具有较好编辑效率的质粒转入不同类型的人源细胞(包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞),检测其对不同细胞的基因组编辑情况。同时对参与NHEJ修复的基因(Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Ligase4、XRCC4、XLF、APTX、PNKP、APLF、Td P1、Td P2、Artemis、Metnase、WRN、Mre11、poll、polm、TDT)进行表达分析,对这些修复基因在人源不同类型细胞的表达中是否存在差异性进行初步的考察。三、CRISPR-Cas9系统的腺病毒载体构建及条件优化为了以后进一步探究CRISPR-Cas9-TCR系统对于T细胞的基因编辑情况,基于以往工作基础,首先需要将CRISPR-Cas9-TCR系统进行腺病毒载体的构建,以利用腺病毒作为载体将CRISPR-Cas9-TCR系统转入T细胞内。将p X330的U6+g RNA区段和Cas9基因区段分别连入p DC315载体构建穿梭质粒,以便将来分别进行重组腺病毒的包装。其中,U6+g RNA是通过PCR扩增的方法得到,同时在两端引入Eco RI和Xba I的酶切位点,将扩增得到的目的片段与T载体连接构建出过渡质粒,再通过对p DC315和过渡质粒的酶切(Eco RI、Xba I)、连接的系列反应构建得到p DC315-U6+g RNA腺病毒穿梭质粒;在构建p DC315-Cas9的过程中,通过对p DC315质粒的系列改造,在其多克隆位点添加Age I酶切位点,进而达到能够与Cas9片段进行粘末端连接的目的。将改造后的p DC315和p X330分别进行一系列酶切(Age I、Eco RI、Xba I)、连接等反应构建出p DC315-Cas9腺病毒穿梭质粒。结果:一:CRIPSPR-Cas9-TRAC质粒构建成功,并完成功能验证及脱靶率检测基于p X458质粒,将针对TRAC设计的三个靶位点分别构建出敲除质粒(p X458-site1、p X458-site2、p X458-site3),将这三种质粒利用磷酸钙转染法分别导入293T细胞系,流式细胞术检测这三种质粒的转染效率:p X458-site1为38.4%,p X458-site2为30.5%,p X458-site3为37.8%。转染72h后对这三组细胞分别提取基因组DNA,通过PCR扩增以及PCR产物的直接测序,可知p X458-site2质粒发生了有效编辑,通过T-A克隆和单克隆测序分析可知,在35个单克隆中有8个发生了基因编辑,综合考虑转染效率,其基因编辑效率为74.7%。针对10个易脱靶位点进行了PCR扩增及PCR产物的测序,结果表明这10个位点均未发生基因编辑现象,可知p X458-site2具有较好的靶向性。二、CRISPR-Cas9系统对于不同细胞系的编辑情况存在差异将p X458-site2分别转入HEK-293、Hela、SW480细胞系,流式细胞术检测其转染效率如下:HEK-293为29.4%,Hela为17.7%,SW480为21.9%。转染72h后提取各组细胞的基因组DNA,通过PCR扩增、T-A克隆、测序等系列实验可知:293细胞系的25个克隆中有5个发生了基因编辑,其中4个发生了A/T插入,且插入位点均位于PAM位点上游的第三个碱基处,编辑效率为68%;Hela细胞系的45个克隆中有1个发生了编辑,编辑情况为A/T碱基的插入,编辑效率为13.47%;SW480细胞系的56个克隆有4个发生了基因编辑,其中有两个发生了A/T插入,且插入位点均位于PAM位点上游的第三个碱基处,基因编辑效率为32.7%。利用Pubmed网站下载参与NHEJ修复的基因(Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Ligase4、XRCC4、XLF、APTX、PNKP、APLF、Td P1、Td P2、Artemis、Metnase、WRN、Mre11、poll、polm、TDT),并设计出相应的上下游引物,通过PCR扩增后,对这些基因的表达情况进行了分析,结果表明这些基因在不同细胞内的表达确实存在差异性,为后续的相关研究奠定了基础。三、CRISPR-Cas9系统的两个腺病毒穿梭质粒构建成功成功构建出p DC315-U6+g RNA和p DC315-Cas9腺病毒穿梭质粒。结论:成功构建出了TRAC敲除质粒,并证明p X458-site2具有较好的编辑效率,且通过检测可知其脱靶率很低;在CRISPR/Cas系统对不同类型人源细胞的基因编辑情况中,发现编辑效率和编辑结果有所差异,分析原因可能与参与NHEJ过程的基因表达差异有关,并对该推论进行了初步的验证,证明了差异性的存在,该结果为今后不同细胞内NHEJ修复机制的差异研究奠定了基础;此外还成功构建了CRISPR-Cas9系统重组腺病毒载体(p DC315-U6-g RNA、p DC315-Cas9),为后续针对T细胞的相关研究奠定了基础。