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研究目的伊马替尼(Imatinib,IM),第一代酪氨酸激酶抑制剂,是治疗慢性粒细胞白血病(chronic mycloid leukemia,CML)的临床一线用药,但随着其耐药的出现,寻找低毒、有效,且能克服IM耐药或增敏IM作用的药物是众多学者研究热点。汉防己甲素(Tetrandrine,Tet)是一种从防己科植物-粉防己的块根中提取的生物碱,是天然性的非选择性的钙通道阻滞剂,同时又是钙调蛋白的拮抗剂。在体外和体内的研究表明,汉防己甲素是一种广谱肿瘤抑制剂,可选择性地诱导肿瘤细胞凋亡。本课题旨在研究Tet和IM单独及联合应用对耐伊马替尼的慢性粒细胞白血病急变期K562/G01细胞株的增殖抑制、诱导凋亡的作用,并初步探讨其可能的诱导凋亡的机制。研究方法1.MTT法检测IM、Tet单药及联合用药对细胞增殖抑制作用的影响;2.流式细胞术(FCM)检测各实验组细胞周期及细胞凋亡率;3.实时荧光定量PCR检测各组细胞caspase-3、bcl-2基因的表达量;4.Western Blot分析各组细胞caspase-3、bcl-2蛋白的表达。研究结果1.MTT法检测结果示:不同浓度(0-24μmol/L)的Tet分别作用于K562/G01细胞24h、48h,均能明显抑制细胞的增殖,其作用具有时间-浓度依赖性,各浓度组间有显著性差异(P〈0.05),Tet对K562/G01细胞24h、48h的IC50值分别为(10.83±0.76)μmol/L、(7.53±0.32)μmol/L。同样不同浓度(0-10μmol/L)的IM对K562/G01细胞的增殖抑制作用也具有时间-浓度依赖性。两药联合作用后对K562/G01细胞48h的抑制作用明显高于Tet、IM单药组,差异具有统计学意义(P均<0.05)。2.流式细胞术(FCM)检测细胞周期结果示:Tet、IM单独用药后K562/G01细胞呈G1期阻滞,联合用药后其阻滞作用更为明显(P<0.05)。3.流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率结果示:Tet单独作用于K562/G01细胞48h对早期和晚期凋亡率有一定的影响,并呈浓度依赖性。单独应用1μmol/LIM对细胞凋亡作用不明显,联合1.5μmol/L、3μmol/L的Tet能明显提高IM对K562/G01细胞的凋亡作用(P<0.05)。4.实时荧光定量PCR检测结果示:经Tet1.5μmol/L、3μmol/L,IM1μmol/L处理K562/G0148h后,在细胞中caspase-3的相对表达量与对照组相比明显增加,联合用药组作用更明显,差异有统计学意义(P<0.05)。细胞经相同处理后bcl-2的相对表达量逐渐减低,两药联合后差异具有显著性(P<0.01)。5.Western blot结果示:与对照组相比,1μmol/L IM和1.5μmol/L Tet的单药组分别作用于K562/G01细胞48h后,各组细胞中caspase-3、bcl-2蛋白的表达变化不太明显,联合用药后能使bcl-2蛋白的表达明显减低,而caspase-3蛋白的表达显著增高。结论1. Tet单药组及联合IM用药组对K562/G01细胞均有明显的增殖抑制作用,并且呈时间-浓度依赖性,且联合用药组作用更强,提示Tet有增敏IM的作用;2. Tet单药组及联合IM用药组可以诱导K562/G01细胞的凋亡,且联合用药组凋亡作用更显著,可能与影响细胞周期有关。3. Tet单药组与联合IM用药组能上调caspase-3基因的mRNA及其蛋白的表达水平、下调bcl-2基因的mRNA及其蛋白的表达水平,这可能是Tet诱导K562/G01细胞凋亡作用的机制之一。