猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是猪的一种高度接触性肠道传染病,以呕吐、腹泻、脱水为主要特征,病原为猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。2010年底以来,我国南方多省暴发PED,仔猪感染率达100%,致死率80%～100%,造成了巨大的经济损失。近几年,研究人员通过分离PEDV流行毒株和全基因测序发现,流行毒株与传统毒株CV777相比,基因组变异较大,尤其是S基因,存在碱基插入、缺失和突变。本研究根据PEDV传统毒株和变异毒株S基因特征,并参照实验室已建立的方法,设计合成了引物,建立了可以同时鉴别PEDV流行毒株和传统毒株的real-time PCR和RT-PCR方法,并将两种方法进行比较,结果显示,两种方法均可鉴别诊断PEDV传统毒株和变异毒株,real-time PCR更为敏感。本研究具体内容如下:1.PEDV传统毒株和变异毒株PCR鉴别检测方法的建立本研究根据PEDV传统毒株和变异毒株S基因序列,并参照实验室已建立的方法,设计合成了引物,通过部分条件的优化,分别建立了能鉴别两种毒株的real-time PCR和RT-PCR方法。通过敏感性、重复性、特异性等试验对两种方法进行了比较。特异性实验结果显示:两种PCR方法均可以鉴别诊断PEDV传统毒株和变异毒株,并能区分PEDV与其他病毒,具有良好的特异性;常规RT-PCR方法检测PEDV传统毒株和变异毒株的最小浓度均为4 × 105copies/μl,real-time PCR方法检测传统毒株和变异毒株的最小浓度为4×102copies/μl,是常规RT-PCR敏感性的1000倍;real-time PCR方法,起始模板浓度与Ct值之间具有良好的线性关系,相关系数R2大于0.996;重复性试验中,real-time PCR变异系数小于2%,用常规RT-PCR对4份样品进行三次重复检测,结果一致。上述结果表明,两种方法均可以鉴别诊断PEDV的传统毒株和变异毒株,并具有良好的特异性、敏感性和重复性。通过比较,real-time PCR方法具有更好的敏感性。2.两种PCR方法的临床应用为比较两种PCR方法的临床应用效果,分别用real-time PCR方法和常规RT-PCR方法对采集的72份腹泻样品进行检测。结果如下:real-time PCR方法检测到51份阳性,其中传统毒株12份,变异毒株39份;常规RT-PCR方法检测到26份阳性,其中传统毒株3份,变异毒株23份。且传统RT-PCR检测到的阳性病料,real-time PCR方法检测也都为阳性。根据real-time PCR的检测结果,经计算分析,传统RT-PCR只能检测到高于104 copies/μl的病料。试验结果表明两种方法均可用于临床检测,real-time PCR比常规RT-PCR方法更敏感,更适于临床检测。