衰老作为一种正常而复杂的生命过程,涉及机体的不同组织、细胞的一系列特定程序性变化。下丘脑-垂体-性腺轴(H-P-G-A)的发生发育、成熟与衰老是生命活动的重要方面。免疫-神经-内分泌网络在衰老过程中起重要作用,而H-P-G-A是该网络的重要组成部分。众多研究表明,细胞衰老过程是借助于信号传导途径实现的,许多细胞因子亦参与到这些信号途径中。当这些途径所涉及的关键调节因子发生改变,细胞将延缓衰老或绕过衰老程序继续增殖。本实验采用D-半乳糖致亚急性衰老的雌性大鼠模型,以细胞衰老信号转导途径中涉及的关键调节因子p53、p19ARF、Rb及p16等为介入点,从分子生物学角度探讨何首乌饮对延缓下丘脑-垂体-卵巢轴(H-P-O-A)衰老的作用机制,并且通过检测下丘脑、垂体、卵巢组织IGF-1、IGF-BP、TNF-α、EGF、EGFR的表达及电镜超微结构变化等,从多层次、多环节阐明哺乳动物衰老机制,以及何首乌饮对下丘脑-垂体-卵巢轴的抗衰老作用。1.目的应用RT-PCR、Western blotting、原位杂交及免疫组化方法检测衰老模型大鼠下丘脑、垂体、卵巢组织p53、p19ARF、Rb和p16、EGF、EGFR、TNF-α、IGF-Ⅰ、IGFBP3的表达,并且从下丘脑、垂体和卵巢三个层次来观察H-P-G-A衰老的组织学变化,以及何首乌饮对该轴的作用,从而探讨大鼠性腺轴的衰老机制,分析何首乌饮抗衰老的作用。2.方法2.1实验动物的选取、分组及模型的建立:选用8周龄清洁级SD雌性大鼠96只随机分为正常组、模型组、预防组。预防组又分为何首乌饮低剂量组、何首乌饮中剂量组、何首乌饮高剂量组、何首乌丸组,每组动物各16只。用6%的D-半乳糖溶液腹腔注射的方法连续用药60d,建立亚急性衰老大鼠模型。预防组在腹腔注射D-半乳糖溶液的同时给药何首乌饮、何首乌丸。2.2标本的采集及研究方法:连续用药60d后,取各组大鼠的下丘脑、垂体前叶和卵巢新鲜组织,应用RT-PCR法检测其p53、p19ARF、Rb、p16及IGFBP3的基因水平,应用Western blotting方法检测Rb及p16蛋白的表达。将各组大鼠用不同的固定液进行左心室灌注,最后取其下丘脑、垂体前叶、卵巢组织,应用免疫组化法检测p53、EGF、EGFR、TNF-α蛋白的表达,应用原位杂交技术检测IGF-ⅠmRNA的水平,应用透射电镜观察下丘脑、垂体前叶及卵巢组织超微结构的变化。3.结果3.1大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb衰老途径中关键调节因子发生改变,应用何首乌饮可纠正这些因子的过度表达:3.1.1 PCR结果显示,模型组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织中p53基因表达明显高于正常组(P<0.01),给予不同剂量的何首乌饮预处理后,p53基因表达比模型组降低(P<0.05)。在下丘脑和垂体前叶,低剂量组p53基因表达低于何首乌丸组(P<0.05);而在卵巢,高剂量组p53基因表达低于何首乌丸组(P<0.05)。免疫组化结果显示,模型组大鼠下丘脑弓状核、垂体前叶、卵巢组织中p53的染色明显强于正常组(P<0.01),给予不同剂量的何首乌饮预处理后,p53染色比模型组降低(P<0.05)。在垂体前叶组织中,低剂量组p53染色弱于何首乌丸组(P<0.05);而在卵巢组织中,高剂量组p53染色弱于何首乌丸组(P<0.05)。3.1.2 PCR结果显示,模型组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织中p19ARF基因明显升高(P<0.01),给予不同剂量的何首乌饮预处理后,与模型组相比,p19ARF基因表达明显降低(P<0.01,P<0.05)。在下丘脑,低剂量组p19ARF基因表达低于何首乌丸组(P<0.05);而在卵巢,高剂量组p19ARF基因表达低于何首乌丸组(P<0.05)。3.1.3 PCR结果显示,模型组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织中Rb基因表达明显高于正常组(P<0.01),给予不同剂量的何首乌饮预处理后,Rb基因表达明显比模型组降低(P<0.01,P<0.05)。在下丘脑和垂体前叶,低剂量组Rb基因表达低于何首乌丸组(P<0.05);而在卵巢,高剂量组Rb基因表达低于何首乌丸组(P<0.05)。Western结果显示,模型组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织的Rb蛋白表达明显高于正常组(P<0.05),不同剂量的何首乌饮各组下丘脑、垂体前叶、卵巢组织的Rb蛋白表达明显低于模型组(P<0.05)。在垂体前叶,低剂量组Rb蛋白表达低于何首乌丸组(P<0.05);而在卵巢,高剂量组Rb蛋白表达低于何首乌丸组(P<0.05)。3.1.4 PCR结果显示,模型组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织中p16基因表达明显高于正常组(P<0.01),给予不同剂量的何首乌饮预处理后,p16基因表达比模型组降低(P<0.01,P<0.05)。在下丘脑,低剂量组p16基因表达低于何首乌丸组(P<0.05)。Western结果显示,模型组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织的p16蛋白表达明显高于正常组(P<0.01,P<0.05),不同剂量的何首乌饮各组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织的p16蛋白表达明显低于模型组(P<0.01,P<0.05)。3.2大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴衰老相关细胞因子的表达发生改变,应用何首乌饮可纠正这些因子的异常表达:3.2.1大鼠免疫组化结果显示,衰老模型大鼠EGF在卵巢中的染色明显弱于正常组(P<0.01),EGFR在下丘脑弓状核、垂体前叶、卵巢中的染色亦明显比正常组减弱(P<0.01)。给予不同剂量的何首乌饮预处理后,EGF及EGFR的染色比模型组增强(P<0.01,P<0.05)。3.2.2免疫组化结果显示,与正常组相比,衰老模型大鼠TNF-α在下丘脑弓状核、垂体前叶、卵巢中的染色明显增强(P<0.01)。给予不同剂量的何首乌饮预处理后,TNF-α染色明显比模型组减弱(P<0.01,P<0.05)。在下丘脑弓状核和垂体前叶,何首乌饮各组TNF-α的表达低于何首乌丸组(P<0.05)。3.2.3原位杂交结果显示,衰老模型大鼠卵巢组织中IGF-ⅠmRNA表达明显低于正常大鼠(P<0.01),给予不同剂量的何首乌饮及何首乌丸预处理后,IGF-ⅠmRNA表达比模型大鼠升高(P<0.01)。PCR结果显示,与正常组大鼠相比,模型组大鼠下丘脑、垂体前叶、卵巢组织中IGFBP3基因表达明显上调(P<0.01),给予不同剂量的何首乌饮预处理后,IGFBP3基因表达明显比模型组降低(P<0.01,P<0.05)。3.3衰老大鼠下丘脑弓状核、垂体前叶、卵巢的形态学发生损伤性改变,应用何首乌饮可减缓这种损伤:3.3.1下丘脑弓状核形态学改变:光镜下观察,下丘脑弓状核包括神经元细胞和神经胶质细胞。在模型组,尚发现有大量反应胶质细胞。透射电镜下观察,下丘脑弓状核有暗细胞和亮细胞两类神经元。模型组可见核膜凹陷增多,核膜溶解;溶酶体增多;线粒体嵴断裂、膜融合或消失;粗面内质网脱颗粒;高尔基体扩张。突触前、后膜模糊不清,突触间隙融合。预防各组可见部分核膜溶解;可见溶酶体;线粒体嵴部分断裂、膜部分模糊不清;粗面内质网轻度脱颗粒;高尔基体轻度扩张。突触前、后膜尚清晰,突触间隙部分融合。3.3.2垂体前叶形态学改变:光镜下观察,垂体前叶腺细胞包括嗜酸性细胞和嗜碱性细胞和嫌色细胞。模型组可见腺细胞排列紊乱,血管增生、变性。嗜酸性细胞及嗜碱性细胞数量减少。透射电镜下观察,模型组垂体促性腺激素细胞可见核内异染色质增多,核膜部分溶解;粗面内质网扩张明显;高尔基体增多、扩张;线粒体肿胀,嵴断裂、融合或消失;分泌颗粒增多。预防各组可见促性腺激素细胞粗面内质网丰富,轻度扩张;高尔基体轻度扩张;线粒体肿胀不明显,嵴部分断裂;分泌颗粒轻度增多。3.3.3卵巢形态学改变:光镜下观察,可见各级卵泡及黄体。衰老模型大鼠卵巢中原始卵泡、生长卵泡及黄体均明显少于正常大鼠(P<0.05,P<0.01)。各级卵泡颗粒细胞层次减少,细胞排列紊乱,囊性扩张的卵泡增多。可见颗粒细胞小巢或条索,尚可见炎细胞浸润。预防各组大鼠卵巢中原始卵泡、生长卵泡及黄体多于模型大鼠(P<0.05,P<0.01)。透射电镜下观察,模型组可见细胞内线粒体减少,呈不同程度的肿胀,嵴部分断裂甚至消失;滑面内质网不丰富,轻度扩张;高尔基体肥大。何首乌饮低剂量组可见线粒体扩张显著;滑面内质网轻度扩张;高尔基复合体扩张;脂滴增多,体积较大。何首乌饮中剂量组可见线粒体数目增多,体积增大,部分线粒体肿胀,核膜扩张;胞质内脂滴较多。滑面内质网数目丰富,中度扩张。何首乌饮高剂量组可见细胞结构接近于正常组,线粒体丰富;胞浆中脂滴电子密度高;滑面内质网扩张;有丰富的高尔基复合体。何首乌丸组可见线粒体数目增多,体积增大,部分线粒体肿胀,核膜扩张;胞质内脂滴较多。4.结论1衰老模型大鼠H-P-O-A性腺轴p19ARF/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb衰老途径中关键的调节因子p19ARF、p53、Rb、p16基因及蛋白表达上调,预防性应用何首乌饮对此可以起到抑制作用。2衰老模型大鼠H-P-O-A性腺轴衰老相关细胞因子EGF及其受体EGFR、IGF-Ⅰ及其结合蛋白IGFBP3表达均降低,预防性应用何首乌饮可增加这些细胞因子的表达。3衰老模型大鼠H-P-O-A性腺轴衰老相关细胞因子TNF-α蛋白表达增高,预防性应用何首乌饮可以使TNF-α水平下降。4 D-半乳糖可致大鼠下丘脑弓状核、垂体前叶和卵巢的超微结构发生损伤,预防性应用何首乌饮可以减缓这种超微结构的损伤,从而改善H-P-O-A性腺轴的功能,延缓其衰老。