目的:人食管下括约肌(lower esophageal sphincter, LES)是位于胃食管接合部特殊增厚的环形肌,宽度大约2～3cm。Liebermann-Meffert首次提出人食管下括约肌由位于大弯侧呈斜行分布的套索纤维(sling fibres)和位于胃小弯侧呈半环形的钩状纤维(clasp fibres)共同构成,这两个结构造成LES的收缩与舒张,并在胃食管连接部形成一个高压带(15～30mmHg)。食管测压实验发现人LES的压力是不对称的,高压区偏向左侧,即套索纤维方向[2,3],显然套索纤维和钩状纤维在维持LES压力方面发挥不同作用,但二者作用区别尚未完全明确。人LES的正常功能是由抑制性和兴奋性神经、体液因素以及LES本身的肌源因素等共同调节,保证当吞咽时食管下括约肌舒张并具有抗反流的作用。其中抑制性神经即非肾上腺非胆碱能(nonadrenergic noncholinergic, NANC)神经的神经递质目前还处于研究阶段,一氧化氮(NO)被认为是其中一种神经递质,而血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)是否是NANC神经递质之一尚在争议当中。国外研究发现外源性VIP在一定浓度下能显著降低动物如猫、狗、负鼠等LES的肌张力,尚未证实其对人LES的作用,且并未区分套索纤维与钩状纤维的作用效果。本实验研究VIP对人LES套索纤维和钩状纤维的作用及其差异,并且探索VIP是否属于NANC神经递质,从而进一步了解人LES的生理及药理特性,为食管运动功能障碍性疾病的临床治疗提供理论依据。方法:选取2010年3月到2010年8月在我院因高位食管中段癌行食管大部切除术患者30例,其中男、女各半,平均年龄58岁。术中由术者切取食管胃连接部上下3cm作为研究标本(该部位属于食管中段癌手术切除范围之内,切取该部位作为研究标本不会对手术效果造成任何影响),并在胃大弯侧标记,以防止错误游离。术者切下标本后立即将标本放入盛有4℃Krebs液的烧杯中,迅速送入实验室。实验室室温下将标本以解剖位置固定在盛有Krebs液的蜡盘上,持续向蜡盘的Krebs液内通以5%CO2和95%O2混合气体。沿食管胃长轴通过胃大弯标记点切开标本,将标本展开,粘膜面向上固定在蜡盘上。使用剪刀锐性剥离胃贲门部及食管下段的粘膜层及粘膜下层,此时位于食管胃交界处的发白增厚的肌肉环即为食管下括约肌。肉眼识别出钩状纤维与套索纤维。钩状纤维位于标本的中央呈半环形分布,套索纤维位于标本的两端并呈斜行分布。锐性游离钩状纤维和套索纤维,制备2mm×10mm的肌条。用丝线将肌条两端分别扎紧,置于10ml规格的灌流槽中,灌流槽内提前注入Krebs液10ml,持续通以5%CO2和95%O2的混合气体,并保持37℃恒温。肌条上端经丝线连接于肌肉张力换能器,下端经丝线固定于带铂金电极的L形固定架上,张力信号由Medlab信号采集系统记录。肌条位于两个平行的环形铂金电极中间,肌条上下端与电极环间的距离在3mm以上,铂金电极经导线连接于药理生理实验多用仪行电场刺激(electric field stimulation, EFS)。快速拉伸肌条至产生200mg张力,此时肌条的长度作为初长度L0,然后每15min缓慢牵拉肌条一次使其增加初长度L0的25%,直至肌条达到200%L0作为最适初长度,平衡1h。刺激参数:单脉冲方波、波宽5ms、电压50V、频率1～32Hz以倍数递增。标本平衡1h后,以频率1hz~32hz行电场刺激,只有对电场刺激反应良好的肌条才能继续使用。待肌条恢复平衡后,向浴槽中加入VIP(10–28) (10-5mol/L),对照组加等量蒸馏水,观察肌条张力变化。对未行电场刺激的肌条,加入不同浓度的外源性VIP(10-9～10-6mol/L),建立4轮VIP累计给药的浓度-反应量效曲线。每轮之间间隔时间为肌条平衡后10分钟。待第4轮加药肌条反应平衡后10分钟,将VIP(10-28) (10-5mol/L)加入浴槽中。并观察外源性VIP影响下,VIP(10–28) (10-5mol/L)对套索纤维和钩状纤维是否会发生肌条张力变化的作用。同时设对照组,向未行任何实验的肌条浴槽中加入VIP(10-28) (10-5mol/L),观察加药后套索纤维和钩状纤维的肌条张力变化。EFS和药物诱发的舒张反应均以肌条舒张百分比的mean±SD表示。两条浓度-反应量效曲线之间的比较,采用双因素方差分析,当F值有显著性(P<0.05)时,进一步采用Bonferroni’s test检验比较两对应浓度间的药物效应。统计学分析及图形处理使用Spass13.0和GraphPad Prism软件。结果:1外源性VIP对人食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的影响外源性VIP(10-9～10-6mol/L)不同浓度下均可使套索纤维和钩状纤维产生浓度依赖性舒张反应,二者在相同VIP浓度下(10-9～10-6mol/L)张力变化的差异具有统计学意义(P<0.05),套索纤维舒张程度明显大于钩状纤维。2外源性VIP作用下,VIP(10-28)对人食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的影响VIP(10-28)能够短暂一过性抑制外源性VIP的作用,表现为加药后,原本在外源性VIP作用下表现为舒张的套索纤维和钩状纤维肌条,均出现短暂一过性的收缩,肌条张力增大。对照组肌条张力无任何变化。3 EFS作用下,VIP(10-28)对人食管下括约肌套索纤维和钩状纤维的影响VIP(10-28) (10-5mol/L)对EFS作用后的套索纤维和钩状纤维均产生了短暂一过性的抑制作用,表现为加药后套索纤维和钩状纤维肌条均出现短暂一过性的收缩,肌条张力增大。而蒸馏水对照组肌条张力无明显变化。结论:本实验研究VIP对人LES套索纤维和钩状纤维的作用及其差异,并且探索VIP是否是人LES内NANC神经递质,发现VIP作用于人LES套索纤维和钩状纤维能使之产生浓度依赖性舒张反应,套索纤维和钩状纤维在相同浓度下舒张变化的差异具有统计学意义,套索纤维的舒张作用大于钩状纤维;电场刺激EFS诱导钩状纤维和套索纤维的舒张与VIP有关,实验结果支持VIP是人LES内NANC神经递质之一。