背景视神经炎是指视神经的各种炎性病变,是青壮年人群中常见的视神经疾病,其中特发性脱髓鞘性视神经炎是最常见的类型,其病因和发病机制仍不明确,临床特点是可导致患者视力突然下降,部分患者甚至可下降到无光感,可伴有色觉异常和视野损害。与西方国家相比,中国的视神经炎患者发病时视力损害更为严重,恢复困难,且双眼发病非常常见。特发性脱髓鞘性视神经炎的病理变化特征在于炎性炎症浸润、少突胶质细胞减少、髓鞘和轴索损伤、神经胶质增生和神经变性。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型与人类特发性脱髓鞘性视神经炎在病理改变、影像学及视觉电生理检查方面有许多相似之处,是目前研究视神经炎较为理想的动物模型。在病理改变和临床表现上,髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55诱导的C57BL/6小鼠的EAE模型最接近人类多发性硬化(MS),故在大部分MS和视神经炎的研究中为首选的动物模型。视神经炎病程中存在视网膜神经节细胞(RGCs)的凋亡,从而导致视网膜神经纤维层变薄,影响视力恢复,而RGCs的凋亡与免疫炎症反应及氧化损伤有关。其中,在EAE的免疫发病机制中,存在着Th1/Th2/Th17/Treg四类主要CD4+T细胞及其相关细胞因子的失衡。近几年越来越多的研究证实Th17/Treg失衡在中枢神经系统脱髓鞘疾病和EAE的发病机制中起着重要的作用。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是细胞质或细胞核定位的,长度大于200个核苷酸的非蛋白质编码RNA,并且它们的表达是具有组织特异性的。近年来的研究发现,lncRNA通过改变染色体结构、控制m RNA的成熟与转运、控制蛋白质的合成等机制参与着体内的绝大部分生物学过程。对于免疫系统而言,lncRNA可调控T淋巴细胞和B淋巴细胞的分化、活化、增殖、凋亡以及细胞因子的表达,从而参与多种自身免疫性疾病的发生发展。在目前的报道中,有多个lncRNA(例如MEG3、TUG1、IFNG-AS1、ZFAS1、HOTAIR等)在T淋巴细胞分化、神经元变性及中枢神经系统脱髓鞘疾病中发挥作用。MS和视神经脊髓炎(NMO)患者的lncRNA表达谱测定及后续生物信息学分析提示,在外周血中存在不同lncRNA表达的上调和下调,且lncRNA与炎症反应、细胞因子活性、神经元凋亡等方面有关,但lncRNA在视神经炎及EAE中的作用机制并未见相关报道。在研究中我们筛选并验证了视神经炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)中与自身免疫性疾病有关的lncRNA,从中选取表达差异较大的lncRNA,通过上调或下调其在C57BL/6小鼠EAE模型中的表达水平,研究其对EAE小鼠的发病和疾病进展、视神经损害和免疫系统的影响,阐述其在实验性视神经炎中的发病机制,为未来视神经炎的诊断及治疗提供新的方向。第一部分自身免疫性疾病相关lncRNA在视神经炎患者外周血中的表达目的:研究自身免疫性疾病相关的lncRNA(MEG3、TUG1、IFNG-AS1)在视神经炎患者PBMCs中的表达情况,筛选出下一步研究的lncRNA。方法:抽取视神经炎患者和正常人外周静脉血,使用密度梯度离心法分离PBMCs,提取总RNA后逆转录,运用实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测lncRNA MEG3、TUG1和IFNG-AS1的相对表达水平。结果:视神经炎患者PBMCs中lncRNA MEG3、TUG1、IFNG-AS1的表达水平较正常人相比均有所升高。其中lncRNA MEG3的相对表达量为正常人的6.87倍(P=0.024),lncRNA TUG1的相对表达量为正常人的2.09倍(P=0.109),lncRNA IFNG-AS1的相对表达量为正常人的3.48倍(P=0.087)。Lnc RNA MEG3的表达水平较其他两个lncRNA高。结论:Lnc RNA MEG3在视神经炎患者外周血单个核细胞中表达水平明显升高,有望成为视神经炎的生物标记物辅助诊断。第二部分Lnc RNA MEG3对实验性视神经炎视神经损害的影响目的:研究上调或下调lncRNA MEG3的表达水平对实验性视神经炎视神经损害的影响方法:建立MOG35-55诱导的C57BL/6小鼠EAE模型,将小鼠分为6组:正常组、EAE组、MEG3-CON组、MEG3-RNAi-CON组、MEG3组、MEG3-RNAi抑制组,免疫后每日记录小鼠的体重及神经功能评分。在腺相关病毒载体的构建中,我们通过构建lncRNA MEG3的全长序列达到过表达lncRNA MEG3的目的,同时利用小干扰RNA(si RNA)的原理造成lncRNA的沉默。在免疫后第3天通过尾静脉注射进行AAV的转染上调或下调EAE小鼠体内lncRNA MEG3的表达水平。在疾病高峰期时对各组小鼠行闪光视觉诱发电位(VEP)检查,记录P1、P2波的潜伏期和振幅,行光学相干断层成像(OCT)检查测量视盘周围的视网膜神经纤维层(RNFL)厚度。取视神经切片行HE染色观察视神经的神经纤维及炎症细胞的浸润情况,取眼球切片行HE染色观察视网膜全层结构。结果:每个实验组的小鼠体重均随时间推移逐渐升高,且所有EAE小鼠的体重在观察过程中均出现上下波动的情况。EAE小鼠在免疫后第9-13天发病,神经功能评分在发病后数天内达到最高值,维持数天后下降。在视神经的组织病理学检查中,我们发现与MEG3-CON组相比,MEG3组视神经纤维排列更加紊乱,视神经纤维之间和视神经周围有更多的炎性细胞浸润,视网膜神经纤维层水肿更加明显。相反,与MEG3-RNAi-CON组相比,MEG3-RNAi组的视网膜神经纤维层水肿较轻,视神经纤维之间和视神经周围炎性细胞浸润相对较少。在闪光VEP检查中,与正常对照组相比,EAE对照组的P2波潜伏期有所延长(39.15±5.52ms vs 64.52±8.0ms,P=0.025)。组织病理学检查和VEP检查提示EAE小鼠发生视神经的改变,视神经疾病模型建立成功。与MEG3-CON组相比,MEG3组的P2波潜伏期明显延长(65.31±13.55ms vs 93.29±29.94ms,P=0.003)。与MEG3-RNAi-CON组相比,MEG3-RNAi组的P1波潜伏期(38.73±5.8ms vs29.12±10.25ms,P=0.029)和P2波潜伏期明显缩短(72.85±19.32ms vs 56.31±7.0ms,P=0.036)。在OCT检查中,与正常组相比,EAE组的颞侧RNFL厚度有所变薄(33.0±1.73μm vs 20.75±6.08μm,P=0.043),但鼻侧、上方、下方及平均RNFL厚度的差异均无统计学意义。与MEG3-CON组相比,MEG3组的颞侧、鼻侧、上方、下方及平均RNFL厚度的差异均无统计学意义。与MEG3-RNAi-CON组相比,MEG3-RNAi组的颞侧、鼻侧、上方、下方及平均RNFL厚度的差异均无统计学意义。结论:在EAE小鼠模型中,过表达lncRNA MEG3加重视神经及视网膜神经纤维层的水肿及炎性细胞浸润,延长闪光VEP的P2波潜伏期,降低P2波振幅;抑制lncRNA MEG3可减轻视神经及视网膜神经纤维层的水肿及炎性细胞浸润,缩短闪光VEP的P1波和P2波潜伏期。本研究说明lncRNA MEG3可加重实验性视神经炎的视神经损害程度。第三部分lncRNA MEG3对实验性视神经炎淋巴细胞分化的影响目的:研究上调或下调lncRNA MEG3的表达水平对实验性视神经炎脾脏淋巴细胞分化的影响。方法:建立MOG35-55诱导的C57BL/6小鼠EAE模型,将小鼠分为6组:正常组、EAE组、MEG3-CON组、MEG3-RNAi-CON组、MEG3组、MEG3-RNAi抑制组,免疫后每日记录小鼠的体重及神经功能评分。在免疫后第3天通过尾静脉注射进行AAV的转染上调或下调EAE小鼠体内lncRNA MEG3的表达水平。在疾病高峰期使用流式细胞术测定脾脏淋巴细胞中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞和Treg细胞的分布情况,并计算出Th1细胞/Th2细胞比值和Th17/Treg细胞比值。结果:与MEG3-CON组相比,MEG3组Th17细胞/Treg细胞比值升高(0.17±0.19 vs 0.75±0.35,P=0.042),T淋巴细胞占脾脏淋巴细胞的百分比,CD4+T/CD8+T淋巴细胞占T淋巴细胞的百分比,Th1、Th2、Th17、Treg细胞占CD4+T细胞的百分比差异无统计学意义。与MEG3-RNAi-CON组相比,MEG3-RNAi组Th1细胞占CD4+T细胞的百分比降低(8.05±2.60%vs2.32±0.96%,P=0.001),T淋巴细胞占脾脏淋巴细胞的百分比、CD4+T/CD8+T淋巴细胞占T淋巴细胞的百分比、Th2/Th17/Treg细胞占CD4+T细胞的百分比差异无统计学意义。结论:在EAE小鼠模型中,过表达lncRNA MEG3可导致Th17/Treg失衡,而抑制lncRNA MEG3可抑制脾脏CD4+T淋巴细胞向Th1细胞分化。