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玉米赤霉烯酮是一种具有雌激素活性的霉菌毒素,在被霉菌污染的作物饲料中广泛存在,造成饲料业和畜牧业的巨大损失,甚至引发严重的公共卫生问题。来源于Clonostachys rosea的内酯水解酶ZHD101是目前研究最广泛的玉米赤霉烯酮水解酶,能够降解玉米赤霉烯酮(ZEN)和其衍生物玉米赤霉烯醇(ZOL)。相对于底物ZOL,ZHD101对ZEN的水解活力更大,但ZOL比ZEN的毒性更大。因此,本课题进行基于结构的理性合理设计来突变内酯环周边酶的活性区附近的残基,以提高ZHD101对ZOL的水解活性。另外,由于ZHD101热稳定性较低,无法满足饲料生产制粒过程中的温度要求。本课题利用理性设计和分子改造在其分子中引入二硫键,以提高ZHD101的热稳定性。(1)通过对ZHD101-S102A/ZOL的复合体结构的分析,突变体V153H对底物ZEN保持水解能力的同时对底物α-ZOL的活性提高了3.7倍。动力学研究显示,V153H的底物结合能力降低约2.5倍,但转换数却提高5.2倍。通过对解析了ZHD101-S102A/V153H/ZOL的复合体结构的解析与分析,发现底物α-ZOL内酯环的醇羟基与H153的侧链形成氢键,使内酯环平面上移,产生一个空间以容纳H242的摆动,使H242侧链回归重新形成有功能的催化三联体。(2)通过在分子引入七对半胱氨酸双突变(A110C/P196C、S136C/R189C、D143C/P181C、S147C/P181C、D199C/A202C、L200C/A231C、R204C/G205C)以形成潜在的二硫键,研究其对热稳定性的影响。结果表明,突变体S136C/R189C和D143C/P181C在50℃加热处理2 min后的残余活性高于野生型,其中突变体D143C/P181C的残余活性是野生型的2倍。在此基础上设计四突变S136C/D143C/P181C/R189C,热稳定性和活力并不优于双突变D143C/P181C。本研究通过基于结构的理性设计,提高了其对ZEN的高毒性衍生物ZOL的水解能力,对实现玉米烯酮霉素的完全脱毒提供了理论支持。同时,通过定点突变引入二硫键,提高了酶的热稳定性,为其在饲料工业的应用打下了基础。