【摘 要】
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该文根据遗传信息,通过生物信息学方法进行分析,确定研究古细菌Aeropyrum pernix K1中的酯酶/乙酰氨肽酶基因.我们从培养古细菌出发,通过提取基因组DNA,设计PCR引物,再经过PC
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该文根据遗传信息,通过生物信息学方法进行分析,确定研究古细菌Aeropyrum pernix K1中的酯酶/乙酰氨肽酶基因.我们从培养古细菌出发,通过提取基因组DNA,设计PCR引物,再经过PCR反应,克隆出APE1547基因,再将其插入表达质粒pET11a和pET15b,构建工程菌,发酵产酶,通过热变性、Hitrap Q Sepharose离子交换柱层析和Sephacryl S-200凝胶过滤层析获得了电泳纯的超嗜热酯酶APE.APE分子量为63KDa左右,非变性电泳及活力染色电泳确定其为单聚体蛋白.APE的酶学性质研究表明该酶的最适温度为90℃,最适pH为8.0.此酶的最适底物为对硝基苯酚辛酸酯,K<,m>值为14μM,k<,cat>为805.8s<-1>.该酶同时具有乙酰氨肽酶活力,最适底物为乙酰亮氨酸苯胺.该酶具有极强的热稳定性,在0.2mg/ml的酶在90℃半衰期为12小时,在pH偏碱性条件下稳定.我们通过晶体学方法解析出了APE的三维结构,并对酶的结构特征和催化机制及酶的热稳定性机制进行了研究.我们发现该酶由两个主要结构域构成,N端的推进器结构和C端的α/β水解酶结构域.推进器结构域的功能是调节酶的底物特异性,限制过大的分子进入酶的催化部位,同时在酶分子的内部构建出一个催化过程所必须的特殊微环境,酶的催化中心为Ser445、Asp524和His556.酶的催化过程需要经过底物结合、形成过渡态、酰基化酶和酶还原等四个步骤.性质实验和蛋白质分子三维结构证明该酶的热稳定性是其内部的电荷和离子相互作用起了关键的作用.
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