整合素属于细胞表面粘附分子超家族成员，为α亚基和β亚基构成的异源二聚体跨膜糖蛋白。它们通过胞外区与细胞外基质（extracellular matrix，ECM）蛋白结合，通过胞内区与细胞骨架和信号转导蛋白结合，从而介导细胞和细胞、细胞和胞外基质之间的相互作用并参与胞内外双向信号传递。整合素一般依据β亚基分类。β<,3>整合素包括纤维蛋白原（fibrinogen，FB）受体αⅡbβ<,3>和玻连蛋白（vitronectin，VN）受体α<,v>β<,3>，它们在止血与血栓性疾病、骨质再吸收、动脉粥样硬化和血管术后再狭窄、新血管生成、肿瘤转移和病毒感染等病理生理过程中扮演重要角色。因此，研究其表达、活化、与配体结合的结构基础并研发其有效而安全的拮抗剂具有重要意义。 在本研究中，我们首先以定点突变法探讨了β<,3>亚基与配体结合的A结构域内第178位酪氨酸（Y178）突变对α<,Ⅱb>β<,3>受体活化和配体结合的影响。Y178位于决定配体结合特异性的由二硫键相连的loop（C177-C184）结构内。我们以pcDNAzeo（-）／β<,3>野生型（WT）为模板，以PCR介导的定点突变法构建了2种变体即pcDNAzeo（-）／β<,3>Y178A和pcDNAzeo（-）／β<,3>Y178I，并将这3种质粒分别转染已表达α<,Ⅱb>亚基的CHO细胞，使得野生型或变体β<,3>亚基与α<,Ⅱb>亚基共表达于CHO细胞表面并形成α<,Ⅱb>β<,3>复合物。结果显示：两变体β<,3>在CHO细胞表面的表达与野生型相当；Y178A突变使得α<,Ⅱb>β<,3>即使在以DTT刺激后也不能与FB类似物—单抗PAC-1结合；Y178A突变也抑制α<,Ⅱb>β<,3>粘附于固定化的FB。相反，Y178A突变不影响α<,Ⅱb>β<,3>与小分子配体—RGDS肽的结合。然而，α<,Ⅱb>β<,3>的这些配体结合功能却不受另一突变即Y1781的影响。Y178A和Y178I突变对受体结合后事件如粘着斑的形成均没有影响。这些结果提示：Y178可能参与构成另一不同于RGD结合位点的配体结合位点，从而在与大分子配体和配体类似性单抗结合中至关重要。同时，我们的研究也提示178位氨基酸残基具有合适空间大小的侧链结构和疏水作用为维持此结合位点所必需。 其次，我们研究了β<,3>亚基3个氨基酸突变即位于胞外表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）结构域的C560R突变和位于胞内区的D723R和△717突变对α<,Ⅱb>β<,3>和α<,v>β<,3>表达、配体结合功能和受体结合后事件的影响。 C560R突变研究结果显示：C560R突变不影响β<,3>亚基在CHO的表达以及与α<,Ⅱb> 亚基结合成二聚体：但抑制β<,3>与仓鼠内源性α<,v>形成稳定性的复合物。功能研究显示β<,3>C560R突变促进α<,11>bβ<,3>与可溶性或固定化配体的结合；但却强烈抑制α<,v>β<3>介导的细胞粘附。在受体结合后事件方面，该突变使得α<,11>bβ<,3>和α<,v>β<,3>均不能被招募到粘着斑；该突变对表达α<,11>bβ<,3>的CHO细胞的粘着斑相关激酶（focal associated kinase，FAK）酪氨酸磷酸化无作用，却显著抑制表达α<,v>β<,3>CHO细胞的FAK酪氨酸磷酸化。这些表明位于β<,3>亚基EGF结构域的C560R突变对α<,11>bβ<,3>和α<,v>β<,3>的生物合成和功能有不同的影响，即两者的调控机制有所不同。 D723R和A717突变研究结果显示：133胞内46个氨基酸的缺失（β<,3>△717）导致α<,11>bβ<,3>和α<,v>β<,3>表达均显著降低；以一碱性精氨酸替换723位点酸性天冬氨酸（β<,3>D723R）对α<,11>bβ<,3>表达无影响，却抑制该亚基与CHO细胞内源性的α<,v>结合为完整的整合素。在配体结合功能方面，β<,3>△717与D723R均促进α<,11>bβ<,3>和配体结合，但α<,11>bβ<,3>△717比α<,11>bβ<,3>D723R与配体结合能力高3倍；β<,3>△717也能增强α<,v>β<,3>与配体结合，而D723R却抑制α<,11>β<,3>与配体结合。这些结果同样提示α<,11>bβ<,3>和α<,v>β<,3>两者的调控表达和配体结合功能的机制有所不同，而且这2种胞内突变经由不同的途径活化α<,11>bβ<,3>。 最后，我们以表达α<,11>bβ<,3>△717的CHO细胞为免疫原，制备出一株新的单克隆抗体（3C7）。流式细胞分析、免疫沉淀和EDTA处理研究均显示3C7为一抗α<,11>bβ<,3>复合物单抗：血小板被DTT、ADP或凝血酶激活或与配体RGDS肽、FB或FB类似性单抗PAC-1反应后与3C7的结合显著增高，提示3C7为一抗配体诱导位（ligand induced binding site，LIBS）抗体。3C7不能与α<,11>bβ<,3>Y178A结合，表明C177-C184 loop结构很可能参与组成该单抗的抗原表位。体外实验显示3C7强烈抑制血小板与FB的结合：3C7抑制血小板与可溶性FB结合的IC50为：0.3μg/ml；抑制ADP或凝血酶诱导的血小板聚集的IC<,50>分别为：5.6μg/ml和0.05 μg/ml；抑制血小板粘附于FB的IC<,50>为：0.9μg/ml。体内实验显示：3C7在浓度为0.25mg/kg即有效抑制兔动-静脉旁路血栓形成，抑制率为72％。这些结果表明：作为α<,11>bβ<,3>的有效拮抗剂，单抗3C7具有抗血栓价值。