研究背景脊髓损伤(Spinal cord injury,SCI)一直是医学领域最棘手的问题之一,其导致损伤平面以下的机体部分与大脑的联系中断,损伤平面以下感觉、运动、括约肌功能永久性障碍,目前仍无有效的治疗方法。既往认为,中枢神经系统损伤后其再生、修复和功能恢复是绝对不可能的。1981年神经学家在基础研究中证实中枢神经损伤后的神经结构修复是可能的,掀起了各国学者对脊髓修复研究的又一次热潮。SCI后轴突再生障碍的主要原因有:(1)对脊髓的直接损伤及继发炎症使脊髓内功能神经元大量坏死或凋亡且神经元再生困难;(2)脊髓损伤后暴露的髓鞘相关抑制分子、轴突生长抑制性蛋白的大量分泌和释放及继发形成的胶质瘢痕阻碍了轴突的生长和正确连接;(3)损伤造成局部细胞凋亡,致使细胞分泌的神经营养因子减少,破坏了神经元修复和支持轴突再生的微环境。SCI修复机制十分复杂,SCI启动了各种有碍于脊髓再生的基因和调控基因,因而针对单一阻碍脊髓再生因素的干预往往作用有限。目前SCI的修复研究主要集中在以下几个方面:(1)药物治疗:如传统的大剂量皮质类固醇激素(甲基强的松龙)的冲击治疗,可以有效的减轻脊髓的继发性炎症损伤,保护并防止残存的损伤神经元进一步凋亡。目前研究的氯化锂(LiCl)、免疫抑制剂FK506等除了可以保护损伤神经元外,还可以有效的促进损伤轴突再生。(2)细胞移植:细胞移植是目前研究的热点,其原理是利用某些种子细胞可以分泌多种神经营养、粘附和趋化因子,营养并保护损伤神经元、诱导轴突再生及再髓鞘化来修复SCI。既往的研究已为SCI修复提供了较成熟的种子细胞,如:胚胎干细胞(ESCs)雪旺氏细胞(SCs)、嗅鞘细胞(OECs)、神经干细胞(NSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs)、脐血干细胞(UCBCs)等,大量研究证实细胞移植均能够在一定程度上促进脊髓神经功能的恢复。(3)组织移植:随着组织工程学(tissue engineering)的飞速发展,一种更先进的SCI修复理念逐步形成,即修复SCI必须包括组织水平上的重建,整合SCI治疗研究的各种有效策略,在诱导轴突定向再生的同时,减少局部胶质瘢痕形成。目前,应用于脊髓的组织工程支架主要有两种,一种为人工合成可降解高分子生物材料,如:聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物等,另一种为自体或异体组织移植,如异体胚胎脊髓组织、自体肌纤维支架、游离周围神经(free peripheral nerves,FPN)或带血管蒂的游离周围神经(vascul-arized peripheral nerve,VPN)组织移植修复脊髓损伤,也取得了一定的修复效果。(4)改善脊髓局部微环境:SCI后轴突再生困难的另一关键因素就是适宜轴突再生的微环境遭到破坏,各种不利于轴突再生的髓磷脂源性蛋白(myelin,MAG,Nogo-A,Omgp)轴突再生抑制分子大量分泌,而各种神经营养因子(BDNF、GDNF、NGF、NT3等)的缺乏及胶质瘢痕形成阻碍了轴突再生。为此,抑制不利抑制因子分泌提高有利营养因子含量改善局部微环境成为目前研究重点。(5)联合治疗:采取联合不同作用机制的治疗方法,更好的发挥协同作用来促进SCI后神经修复。如细胞移植联合药物共同干预,或者采用组织工程方法将种子细胞复合到人工合成高分子聚合材料或外周神经组织制成的支架后移植,或利用基因工程方法将多种神经营养因子的基因片段转染到种子细胞中,制成可分泌特定营养因子的基因工程细胞来修复SCI均获得了令人欣慰的研究成果。中枢神经系统(CNS)中神经元是终末分化细胞,死亡后不能再生。但近年发现,成熟CNS中如海马区、室管膜下区、脊髓等区域仍存在少量具有分裂增殖能力和多分化潜能的NSCs,对CNS损伤后的修复有重要意义。CNS受损后NSCs表现出活跃的分裂增殖能力,并分化为神经元和胶质细胞等神经组织细胞,但创伤后内源性NSCs修复CNS细胞缺损是远远不够的,最好联合外源性NSCs应用才能达到最佳修复效果。随着对于SCI研究的不断深入,NSCs移植在SCI修复方面展示了良好的前景,为SCI的修复带来了新的希望。而LiCl在临床上做为精神稳定药物广泛应用于抗抑郁和躁狂治疗,近几年发现LiCI无论是在体内还是体外对于神经元都有保护作用。2004年,Jin等发现治疗浓度内的LiCl可以促进大鼠海马部位的神经前体细胞表型分化,并且抑制胶质细胞的增生;同年,Yick等应用软骨素酶ABC(ChABC)联合氯化锂治疗脊髓损伤,发现可以明显促进红核脊髓束神经元的再生,这为氯化锂在以后脊髓损伤治疗上的应用开创了新的平台。本实验应用改良的Allen法制造大鼠急性脊髓损伤模型,体外培养NSCs并观察LiCI对其增殖分化的影响,并将NSCs与LiCI二者结合起来对急性脊髓损伤进行联合干预,观察NSCs移植与LiCl联合干预对于脊髓损伤的修复效果,并探讨其作用机制,为临床进一步应用提供理论依据。目的1、应用改良Allen法进行动物模型建立,并通过行为学、组织学等方法对该模型进行了评价,为相应急性脊髓损伤的基础和临床研究提供基础理论依据。2、体外培养神经干细胞并进行Nestin免疫组化鉴定,观察氯化锂对于神经干细胞增殖分化的影响,为联合修复脊髓损伤打下实验基础。3、观察NSCs移植与LiCI联合干预对于脊髓损伤的修复效果,并探讨其作用机制,为临床进一步应用提供理论依据。方法1、应用多中心动物脊髓损伤打击器(MASCIS Impactor)构建大鼠胸髓(T10)损伤模型,观察脊髓损伤后后肢自发性功能恢复的规律和特点,行组织学检查观察损伤组织特点。2、从新生(生后24小时内)Wistar大鼠的大脑海马中分离NSCs进行体外培养,并对细胞进行Nestin鉴定。3、应用MTT法、BrdU免疫荧光检测观察不同剂量氯化锂对于神经干细胞增殖与分化的影响。4、40只77±5天Wistar大鼠,随机分为对照组、LiCl组、NSCs组、NSCs+LiCl组,制备T10胸髓打击伤模型,术后按照30mg/kg.d剂量持续腹腔给予LiCl,同时脊髓损伤局部移植NSCs。通过BBB评分判断后肢运动功能恢复的程度;通过HE染色观察脊髓白质、灰质及细胞间质损伤情况;通过神经元小体染色(Nissle染色)观察残存神经元状态、分布及再生情况;通过免疫组化染色的方法,观察损伤局部神经元的残留及神经纤维的表达和分布;并以此来综合评价治疗措施对脊髓损伤的修复效果。结果1、应用改良Allen法制作大鼠脊髓损伤模型组内BBB评分差异不大,行组织学检查发现损伤处有空洞形成,神经纤维断裂、稀疏,神经元小体数量减少。25mm×10g的打击方式为推荐方式,既能保证损伤程度,又有利于术后护理。2、应用机械分离乳鼠海马以及悬浮生长的培养方式可以得到Nestin染色阳性的神经干细胞。3、20mmol/L氯化锂组其神经干细胞分化为神经元的比率更高,显示氯化锂能促进NSCs的增殖与分化。4、NSCs组与NSCs+LiCI组BBB评分较LiCl组与对照组在2周后各时段差别有意义;NSCs+LiCl组BBB评分在4周后明显高于NSCs组;组织学检查表明NSCs组与NSCs+LiCl组组织学改变与LiCl组与对照组有显著差别,但是NSCs+LiCl组相对于NSCs组可以更明显的促进神经元再生。结论1、应用改良Allen法制作大鼠脊髓损伤模型具有操作简捷、损伤程度统一,临床模拟程度较高的特点。25mm×10g的打击方式为推荐方式。2、应用机械分离乳鼠大脑海马的体外培养方法可以得到纯度较高的神经干细胞。3、氯化锂可以促进神经干细胞增殖与分化。4、在体移植NSCs联合LiCl修复脊髓损伤,可以保护残存的神经元,促进皮质脊髓束神经轴突再生,引导再生轴突通过损伤区,部分改善后肢运动功能。