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目的:本研究基于现代医学“肠-肝轴”学说和中医“肝脾相关”理论,在前期临床研究和实验研究的基础上,探讨具有健脾化浊功效的消脂益肝方对高脂饮食诱导的模型大鼠非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的防治作用,从该方对“代谢性炎症”与肠道粘膜微生态屏障的影响角度探讨其从脾论治NAFLD的作用机制。方法:1.理论部分:回顾了近年来肠道微生态环境紊乱与NAFLD的相关研究进展,深入分析了中医脾和肠道微生态之间的相关性,并结合导师从脾论治慢性肝病的学术思想,从病因病机角度总结、提出了“从脾论治”防治NAFLD的思路。2.实验部分:无特定病原体级(Specific pathogen free,SPF)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只,随机分为4组,其中空白对照组、中药干预组(消脂益肝方组)、益生菌干预组每组各8只,模型对照组16只。空白对照组以标准饲料饲养,其余3组大鼠均采用高脂饲料饲养,模型对照组每4周随机选取2只大鼠处死以动态评估模型的复制情况,实验历时16周复制出NAFLD模型。于造模第5周,中药组以消脂益肝方12.5g·kg-1d-1的剂量灌胃给药,益生菌组给予双歧杆菌乳杆菌三联活菌片(商品名:金双歧)0.7g·kg-1d-1的剂量灌胃给药,空白对照组和模型对照组予以等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃,每周测量1次体重,根据体重变化调整灌胃剂量,共给药干预12周。于末次给药24h后处死全部大鼠,采集血液和肝脏、回肠组织及粘液、收集结肠内粪便样本。采用生化分析法检测血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)?天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)的水平和肝脏组织匀浆中甘油三脂(triglyceride,TG)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)的含量。采用苏木精伊红染色法(hematoxylin eosin staining,HE)判定肝组织NAFLD活动度积分(NAFLD activity score,NAS);采用油红O染色观察肝脏脂质沉积情况;采用Masson染色观察大鼠肝脏肝纤维化的情况。分别通过光学显微镜和电子显微镜对各组大鼠回肠粘膜组织进行普通病理学和超微病理学观察。采用酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,elisa)检测大鼠血清中tnf-α(tumornecrosisfactor-α)、il-1β(inteleukin-1β)水平。采用鲎试剂显色基质法测定大鼠门静脉血浆脂多糖(lipopolysaccharide,lps)的含量。采用westernblot(免疫印迹试验)法检测大鼠回肠组织中tlr4、nf-κbp65蛋白的表达。采用real-timepcr(sybrgreen)绝对定量法检测分析结肠粪便中4种目标菌群的含量。免疫组织化学染色法检测大鼠回肠组织中occludin、zo-1蛋白的表达。采用elisa法测定肠道粘液中siga的含量。结果:1.各组动物体重和肝指数的比较。试验第16周,与空白对照组比较,模型对照组大鼠体重和肝指数显著升高。而经消脂益肝方干预后,大鼠体重和肝指数均显著下降。2.各组大鼠血清、肝脏匀浆生化指标的比较。与空白对照组比较,模型对照组大鼠血清ast?alt的水平显著升高,而以ast升高更为显著;肝脏匀浆组织中tg、ffa的含量亦升高。而经消脂益肝方和益生菌干预后,大鼠血清中ast?alt和肝脏匀浆中tg、ffa的水平均显著下降。3.各组大鼠肝脏病理形态学改变。与空白对照组比较,模型对照组大鼠肝脏nas积分显著升高,而经消脂益肝方干预后,nas积分显著下降。油红o染色显示模型对照组肝组织中红色脂滴显著增多,融合成片状;消脂益肝方干预组大鼠肝细胞脂滴数量明显减少,较稀疏。肝组织masson染色显示模型对照组胶原纤维染色明显增多,部分标本有纤维间隔形成;而消脂益肝方干预组胶原纤维组织着色明显减少。4.消脂益肝方对nafld模型大鼠代谢性炎症指标的影响。与空白对照组比较,模型对照组大鼠门静脉血浆lps含量和血清il-1β、tnf-α水平显著升高;而消脂益肝方干预可明显降低血浆lps含量和血清il-1β、tnf-α的水平显著下降。5.消脂益肝方对nafld模型大鼠肠粘膜微生态屏障的影响。试验主要从肠粘膜生物屏障、机械屏障、免疫屏障3个角度研究。结果显示:(1)与空白对照组比较,模型对照组大鼠粪便样本中大肠杆菌和阴沟肠杆菌的数量增高,而双歧杆菌和乳酸杆菌数量呈下降趋势;经消脂益肝方干预后大鼠肠道中大肠杆菌和阴沟肠杆菌数量呈下降趋势,而双歧杆菌和乳酸杆菌数量呈上升趋势。(2)与空白对照组比较,Occludin、ZO-1蛋白的表达在模型对照组大鼠肠粘膜显著下调;经消脂益肝方干预后Occludin、ZO-1蛋白的表达有所上调。此外,通过透射电镜观察到模型对照组大鼠回肠紧密连接缩短,桥粒结构疏松,线粒体水肿、内质网扩张,经脂益肝方干预后大鼠回肠紧密连接的形态和完整性均得到一定的改善。(3)与空白对照组比较,模型对照组大鼠回肠TLR4、NF-κBp65蛋白表达显著上调;经消脂益肝方干预后,而TLR4、NF-κBp65的表达水平呈下调趋势。与空白对照组比较,模型对照组大鼠肠道粘液中SIgA的含量显著下降,经消脂益肝方干预组大鼠肠道粘液中SIgA的含量升高。结论:基于“从脾论治”立法的消脂益肝方在保肝降酶(AST、ALT),改善肝脏脂质代谢(TG、FFA)方面具有良好作用。同时,该方能够显著改善肝组织的病理变化,减轻肝脏细胞的损伤。其防治NAFLD的可能机制:消脂益肝方可能通过修复NAFLD模型大鼠紊乱的肠道微生态屏障,从而降低NAFLD模型大鼠门静脉血浆LPS水平和血清炎症因子IL-1β、TNF-α水平,抑制LPS/TLR4途径减轻代谢性炎症所致的继发性肝损伤。